FITC-D-Lys荧光探针的标记原理是什么？

FITC-D-Lys 是由异硫氰酸荧光素（FITC）与 D-赖氨酸通过共价键结合形成的荧光探针，主要用于生物标记和检测领域。以下是综合分析：

一、化学结构与标记原理

核心组成‌

FITC‌：具有异硫氰酸酯基团（-NCS）的绿色荧光染料，激发波长约 495nm，发射波长约 520nm。

D-赖氨酸‌：赖氨酸的 D-型立体异构体，侧链含氨基，具有独特的生物正交性。

连接方式‌：FITC 的异硫氰酸酯基团与 D-赖氨酸侧链氨基通过亲核加成-消除反应形成硫脲键（-NH-CS-NH-）。

物理化学性质‌

溶解性‌：溶于水、DMSO 等极性溶剂，微溶于乙醇。

储存条件‌：需避光保存于 -20℃，防止降解。

纯度标准‌：纯度 ≥95%，标记率 ≥90%。

二、主要应用场景

细胞成像与代谢研究‌

通过 LAT1 转运体进入细胞，追踪 D-赖氨酸的代谢路径。

标记活细菌细胞壁，用于革兰氏阳性/阴性菌的实时成像。

蛋白质工程与标记‌

标记重组蛋白的非天然氨基酸位点，研究蛋白质折叠与功能。

用于荧光示踪蛋白-蛋白相互作用。

生物传感与检测‌

结合纳米材料构建荧光探针，检测 pH、金属离子等。

流式细胞术分析细胞活性及代谢状态。

三、制备与纯化方法

反应条件‌

pH 范围‌：8.0-9.0（碳酸氢钠缓冲液）。

摩尔比‌：FITC 与 D-赖氨酸按 1:1 或 1:2 混合。

反应时间‌：室温下避光反应 1-2 小时。

纯化技术‌

凝胶过滤‌：使用 Sephadex G-25 去除未反应 FITC。

HPLC‌：反相 C18 色谱柱分离产物。

四、技术优势与局限性

优势‌

D-构型避免天然代谢干扰，提升标记特异性。

荧光强度随 pH 变化的特性适用于溶酶体成像。

挑战‌

需优化细胞穿透效率及深部组织成像能力。

需评估探针的细胞毒性与生物相容性。

五、注意事项

实验设计‌：需设置对照组以排除荧光干扰。

储存与使用‌：DMSO 溶液避光储存不超过一个月。