以下是DSPE-PEG2000-CY3标记脂质体制备的标准化流程，整合了薄膜水化法和化学偶联技术的实践：

一、材料准备

脂质成分‌

主膜材：DSPC/DSPG/HSPC等磷脂（占总脂质的60-70 mol%）

胆固醇（调控膜流动性，占20-30 mol%）

DSPE-PEG2000-CY3（荧光标记成分，建议添加量0.5-5 mol%）

溶剂体系‌

氯仿/甲醇混合液（体积比2:1）用于溶解脂质

PBS缓冲液（pH 7.4）或去离子水用于水化

设备‌

旋转蒸发仪、超声破碎仪、聚碳酸酯膜挤出装置（100-200 nm孔径）

二、制备流程

步骤1：脂质混合溶液配制

按设计的摩尔比例称取各组分（例：DSPC:胆固醇=65:30:5 mol%）

用氯仿/甲醇混合液溶解，超声处理10分钟至澄清（有机相体积建议为总水化体积的1/10）

步骤2：脂质膜形成

将混合液转移至圆底烧瓶，40-50℃旋转蒸发至形成均匀薄膜

真空干燥2小时彻底去除溶剂残留

步骤3：水化与均质化

加入预热至50℃的PBS缓冲液（推荐水化体积5-10 mL/g脂质）

涡旋震荡30分钟形成多层脂质体（MLVs）

依次通过400 nm、200 nm、100 nm聚碳酸酯膜挤出10次，获得粒径100-150 nm的单层脂质体

步骤4：纯化与表征

采用超滤离心（MWCO 100 kDa）或透析法去除未包封物质

动态光散射（DLS）检测粒径分布（PDI<0.2为合格）

荧光分光光度计验证CY3标记效率（激发550 nm/发射570 nm）

三、关键控制点

参数技术要求依据来源

PEG化比例≤5 mol%以避免空间位阻效应

挤出温度高于磷脂相变温度（DSPC需≥55℃）

避光操作全程棕色玻璃器皿/遮光环境

CY3稳定性终产物4℃避光保存≤7天

四、替代方案（后修饰法）

若需提高标记效率可采用分步修饰：

先制备含DSPE-PEG2000-NH₂的脂质体

通过NHS酯反应将CY3偶联至表面氨基（pH 8.5缓冲液，4℃孵育12小时）

超滤去除游离染料（需验证偶联效率≥80%）

注：推荐优先采用共混法制备，因其操作简便且对CY3荧光团损伤较小。实验设计需根据具体应用场景调整PEG密度与CY3浓度。