Cy5-Vanillic-Acid，Cy5标记香草酸

香草酸（4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid, VA）为小分子酚酸，具一个羧基与一个酚羟基。将其与近红外染料 Cy5 偶联，可得到兼具酚酸生物活性与强荧光示踪能力的探针，用于：
多酚摄取/代谢追踪、相关通路研究；
载体表面（如纳米颗粒、胶体金、聚合物）可视化修饰；
受体/转运体结合研究与成像。
连接策略：
VA 不含游离胺，稳健的是把 VA 的羧基→酰胺化 与 **Cy5-胺（Cy5-NH₂）**偶联；或先给 VA 接“胺/炔/叠氮”把手，再与 Cy5-NHS 或 Cy5-N₃/炔 进行二步偶联。为降低对染料与芳环的相互淬灭，常加入 短PEG间隔臂（PEG2–PEG8）。
二、反应步骤（3条代表性路线）
路线A（单步酰胺化，VA→NHS酯→与 Cy5-NH₂）
特点：直接；对设备要求低；避免改造Cy5。
活化香草酸
溶剂：无水 DMF（或 DMSO），0.01–0.02 M。
投料：VA（1.0 eq），EDC·HCl（1.2 eq），NHS（1.5 eq），少量 DIPEA（1.5–2.0 eq）或 pH 5.5 MES 缓冲 + 催化量NHS。
条件：冰浴起始，室温避光 30–60 min，生成 VA-NHS 酯（原位使用）。
与 Cy5-NH₂ 偶联
加入 Cy5-NH₂（1.0–1.2 eq），补 DIPEA 至微碱性（pH 7.8–8.5）。
反应：室温避光 2–6 h（或 4 °C 过夜），TLC/HPLC 监控（Cy5 650 nm）。
淬灭与纯化
以水/乙腈(0.1% TFA) 梯度 RP-HPLC 纯化；也可先丙酮沉淀/透析（MWCO 1–3 kDa）再HPLC。
收集主峰，冻干得 Cy5-VA-酰胺（预期收率 40–70%，视Cy5质量与纯化损耗）。
表征
UV-Vis/荧光：λ_abs≈650 nm，λ_em≈670 nm；
HR-MS（ESI）：分子峰 [M+H]^+；
^1H NMR（DMSO-d₆）：酰胺 NH 新信号；芳环位移相对 VA 有变化；
HPLC 纯度 ≥95%（650 nm/280 nm 双通道）。
提示：为抑制酚羟副反应，可先把 酚羟乙酰化（Ac₂O/吡啶，室温 30 min），偶联后用 MeONa/MeOH 轻度脱保护；多数情况下直接做问题也不大。
路线B（先给 VA 装“胺把手”，再用 Cy5-NHS）
特点：Cy5 常见用品是 Cy5-NHS；这条路线与蛋白标记操作相同，稳定高效。

状态：固体/粉末/溶液

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