CY3.5 NHS，又称花青素CY3.5-活性酯或CY3.5标记活性酯，是一种基于CY3.5荧光染料的活性酯衍生物，用于与含氨基的生物分子（如蛋白质、肽、抗体）共价结合，实现荧光标记。CY3.5是一种橙红色至红色荧光染料，具有激发波长约550纳米，发射波长约570纳米的特性，其荧光强度高、光稳定性良好，并且在水溶液中有较好的分散性。通过将CY3.5羧基转化为NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）活性酯，可使其更容易与氨基反应形成稳定的酰胺键，从而实现对生物大分子的标记和修饰。

CY3.5 NHS的制备通常涉及将CY3.5羧基与NHS和碳二亚胺类偶联剂（如EDC，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）反应。具体步骤为：首先在水溶性或有机溶剂体系中加入EDC，使CY3.5的羧基活化形成O-酰基异氰脲中间体，该中间体随后与NHS发生亲核取代，生成CY3.5 NHS活性酯。整个过程通常在弱酸性至中性缓冲液（pH 5.5-7.5）中进行，并在低温或室温下保持避光，以防止染料光降解或水解。生成的活性酯在水溶液中稳定性有限，需在干燥条件下低温保存，避免水分引起水解。

CY3.5 NHS的反应机理主要是通过NHS活性酯的亲核取代反应实现荧光标记。NHS活性酯具有良好的离去基团特性，当其与含有自由氨基（–NH2）的生物分子接触时，氨基的孤对电子攻击酰基碳原子，形成四面体中间体，随后NHS基团离去，生成稳定的酰胺键。这一反应对pH较为敏感，一般在碱性或接近中性的条件（pH 7.0-9.0）下进行，以保证氨基处于未质子化状态，从而增强亲核能力，提高标记效率。反应完成后，通过透析、凝胶色谱或高效液相色谱去除未反应的染料，获得荧光标记的目标分子。

CY3.5 NHS与蛋白质或肽的偶联反应具有一定的选择性，主要针对赖氨酸侧链或N端氨基，同时避免与羧基或其他不活泼官能团反应。偶联效率受溶液pH、温度、反应物浓度和溶剂体系影响，通常在温和条件下数小时至过夜可达到较高标记程度。反应过程中应注意荧光染料的光敏性，避免强光照射导致荧光衰减。

应用方面，CY3.5 NHS可用于蛋白质、抗体、核酸或其他含氨基的分子荧光标记，用于免疫荧光分析、流式细胞术、共聚焦显微镜成像以及分子相互作用研究。通过NHS活性酯的化学反应，CY3.5可稳定地连接于目标分子上，同时保留其荧光性能，实现对生物体系的可视化追踪和定量分析。CY3.5标记体系因其红色近红外荧光特性，在组织穿透力和背景干扰方面表现较好，可与其他荧光探针进行多重标记实验。

总之，CY3.5 NHS是一种通过羧基活化生成的活性酯型荧光探针，其反应机理基于NHS活性酯与氨基的亲核取代形成酰胺键。在适宜的pH和温度条件下，该反应能够高效、温和地实现生物分子的荧光标记，为细胞生物学、分子生物学和分析化学等领域提供可视化手段和工具。

名称：CY3.5 NHS，花青素CY3.5-活性酯

性状：固体或液体

厂家：生物

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