AF633 NHS Ester（Alexa Fluor 633 N-hydroxysuccinimide ester，简称AF633活性酯）是一种常用的红色荧光标记试剂，属于Alexa Fluor染料系列。它将Alexa Fluor 633荧光团与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活性基团结合，使其能够与含伯胺（–NH₂）官能团的生物分子进行共价结合。AF633的激发峰约为633纳米，发射峰约为647纳米，荧光明亮且稳定，位于可见光红色区域，适合与绿色或橙色荧光染料进行多通道联合标记。AF633 NHS Ester在化学修饰、荧光探针构建及生物分子成像中具有广泛应用。

化学反应原理

AF633 NHS Ester的核心反应基于NHS酯与伯胺的亲核取代反应，其化学原理属于酰胺键形成机制。NHS酯是一个活性酯，具有良好的离去基团特性，在弱碱性环境下能够与亲核氨基高效反应。反应过程可以分为几个步骤：

首先，待标记分子（如蛋白质、肽链或修饰核酸）中的伯胺基团在弱碱性缓冲液（通常pH 7.5–8.5）条件下部分去质子化，形成游离的氨基亲核物。这一去质子化过程增强了氨基的亲核性，使其能够攻击NHS酯的碳酰碳（C=O）。

随后，伯胺对NHS酯的碳酰碳发起亲核攻击，形成四中心过渡态。在此过渡态中，NHS基团作为良好离去基团被置换，同时形成稳定的酰胺键，将AF633荧光团牢固连接到目标分子上。离去的N-羟基琥珀酰亚胺作为副产物释放，不影响生物分子的结构和功能。整个反应通常在温和条件下完成，无需高温或强酸强碱环境，从而适合用于敏感蛋白质或活细胞标记。

AF633 NHS Ester的反应效率与多种因素相关。pH值是关键因素，最佳反应范围为pH 7.5至8.5。此范围内，氨基具有较高的亲核性，而NHS酯水解速率可控，确保标记效率和产物稳定性。若pH过低，氨基质子化，亲核攻击能力下降，反应速率降低；若pH过高，NHS酯易被水水解，生成非活性羧酸，从而浪费荧光染料。

溶剂体系对反应同样重要。AF633 NHS Ester通常溶于极性有机溶剂如二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF）中，以提高溶解性并避免NHS酯水解。待标记分子可溶于PBS或碳酸盐缓冲液中，反应通常采用有机/水相混合体系，使标记反应既高效又保持生物分子活性。

温度和反应时间也会影响标记效率。一般室温下反应30分钟至2小时即可完成。对于热敏感蛋白或酶，可以选择低温（如4℃）反应过夜，以保持生物分子结构和功能。标记比例通常根据目标分子氨基数量和所需荧光密度进行调整，AF633 NHS Ester与目标分子摩尔比常在5:1至20:1之间。

反应完成后，可加入含氨基的小分子（如甘氨酸或Tris）封闭未反应的NHS酯，防止非特异性标记。在纯化过程中，可使用透析、凝胶过滤或高效液相色谱（HPLC）去除未反应的染料和副产物，从而获得纯净的AF633标记物。

总结来说，AF633 NHS Ester是一种高效、稳定的红色荧光标记试剂，其化学反应原理基于NHS酯与伯胺的亲核取代反应，生成稳定的酰胺键。该反应在温和、弱碱性条件下进行，反应特异性高，荧光染料性质稳定。AF633 NHS Ester广泛应用于蛋白质、肽、核酸标记、FRET体系构建、多通道荧光成像及生物分子功能研究中，是化学生物学和分子生物学研究中重要的荧光工具。

厂家：瑞禧生物

产品目录

CY7丙酮酸 CY7-Pyruvic Acid
CY7大黄素 CY7-Emodin
CY7蛋白A标记物 Cy7-marker protein A
CY7刀豆蛋白A CY7-Concanavalin-A
CY7刀豆球蛋白A CY7-ConA