围绕该类分子构建需求，西安瑞禧生物提供荧光标记定制服务，涵盖 Cy3、Cy5 等多种染料体系，支持多肽及蛋白的修饰、偶联与定制合成，并提供相应的纯化与分析支持，助力相关研究工作的开展。

一、标记原理

1. 分子基础

• 人源胰岛素：5.8 kDa，A 链（21aa）+B 链（30aa），3 对二硫键稳定构象，含表面赖氨酸（Lys）游离氨基（标记位点）。

• Cy3 染料：橙红色花菁染料，激发 / 发射 = 550 nm/570 nm，量子产率高、光稳性好；常用Cy3-NHS 酯（活性酯）为反应形式。

2. 反应机制（NHS 酯 - 氨基偶联）

1. 反应基团：Cy3-NHS 酯 + 胰岛素 Lys 的 ε- 氨基

2. 反应条件：pH 7.2–7.5（中性微碱）、4℃避光、1–2 h，温和不破坏二硫键与活性位点

3. 产物：稳定酰胺键（–CONH–），Cy3 共价接枝，无脱落、无背景干扰

4. 标记密度：摩尔比 1:1~1:3（Cy3: 胰岛素），控制 1–2 个 Cy3 / 分子，平衡信号与活性

3. 核心优势

• 构象完整：不影响受体结合域，保留≥90% 生物活性

• 光学稳定：生理条件下荧光不衰减，适配共聚焦、流式、活体成像

• 定量精准：荧光强度与胰岛素浓度线性相关

二、定制要点

1. 原料质控

2. 工艺关键参数

• 蛋白浓度：2–5 mg/mL（过低效率低、过高易聚集）

• 摩尔比：Cy3:Insulin=5:1~10:1（反应过量，纯化后 DOL=1–2）

• 纯化方式：G-25 凝胶过滤 + 超滤脱盐，去除未反应 Cy3 与小分子

• 质控检测

1. 偶联比（DOL）：UV-Vis 测 550 nm（Cy3）/280 nm（蛋白），计算 DOL=1.0–2.0

2. 活性验证：细胞受体结合实验（保留≥90% 天然活性）

3. 稳定性：4℃避光 30 天、-20℃6 个月，信号与活性无衰减

3. 定制方案（按需选择）

• 标准定制：Cy3 - 人胰岛素，DOL=1.0–1.5，通用细胞 / 体外实验

• 高活性定制：DOL=0.8–1.0，位点选择性标记（避开受体域）

• 高亮度定制：DOL=1.5–2.0，弱信号 / 活体成像

三、案例与文献

案例 1：Cy3-Insulin 用于 3T3-L1 脂肪细胞内吞研究

• 背景：研究胰岛素受体介导内吞与 recycling 机制

• 定制参数：人源胰岛素、Cy3-NHS、摩尔比 8:1、pH 7.4、4℃ 1.5 h、G-25 纯化、DOL=1.2

• 实验结果

• 共聚焦：Cy3-Insulin 与胰岛素受体共定位，清晰示踪膜结合→内吞→胞内转运

• 流式：定量细胞摄取效率，IC50 与天然胰岛素一致

• 应用：发表于《JBC》，支持胰岛素信号通路机制研究