荧光染料可对蛋白质、核酸和聚糖等其他结构进行染色，即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。利用荧光物质与相应抗体或抗原发生特异性结合后，可对待测物进行定位、定性和定量的分析，此方法具有高度特异性、敏感性和直观性，是最早出现的免疫标记技术。

当荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。其特点为在接受能量后即可引起发光，而一旦停止供能后，荧光随之瞬间消失。

荧光素是最常见的荧光染料之一。与强碱反应生成荧光素盐，易溶于水，并有强烈绿色荧光，荧光量子产率0.65（pH=7水溶液）。可使许多生物具有荧光的物质。它与ATP形成复合物（荧光素腺苷），然后再与荧光素酶(Luciferase)结合。

FITC:异硫氰酸荧光素(FITC) 是一种有机荧光染料，发射波长为520 nm的荧光染料，是目前最常用的荧光标志物；它的激发波长接近488 nm，光量子得率高，但受pH影响较大。目前，这种荧光染料仍用于免疫荧光和流式细胞术中。

在 495/517 nm 处，该染料会产生激发/发射峰值，并可借助异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合，该基团可以和蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合。而它的基本成分—— 荧光素，其摩尔质量为 332 g/mol，常被用作荧光示踪剂。FITC(389 g/mol) 是用于荧光显微镜技术的首批染料，且其被当成 Alexa Fluor®488 等后续荧光染料的发端。该染料的荧光活性取决于它的大共轭芳香电子系统，而该系统受蓝色光谱中的光所激发。

TRITC:四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸(TRITC) 是经常与 FITC 同时使用的另一种染料，由最大波长为 550nm的绿色光谱中的光所激发，其最大发射波长为 573 nm。TRITC (479 g/mol) 并非荧光素，而是罗丹明家族的衍生物，罗丹明也具有一个大的共轭芳香电子系统，正是该系统引发了它们的荧光行为。

虽然 FITC 和 TRITC 仍在使用，但由于它们属于发光相对较弱的荧光染料且它们的优势仅仅是经济实惠，因此，在最新的显微镜技术中并不推荐。

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