DSPE-PEG-COOH偶联蛋白效率低怎么办？西安瑞禧生物提供羧基活化优化及蛋白修饰脂质体定制

一、DSPE-PEG-COOH偶联蛋白效率低怎么办？

DSPE-PEG-COOH偶联蛋白效率低时，应优先检查羧基活化效率、NHS活性酯水解、蛋白表面氨基可及性及PEG磷脂修饰比例。可采用EDC/Sulfo-NHS活化DSPE-PEG-COOH末端羧基，再与蛋白表面的伯氨基形成酰胺键，实现蛋白与脂质体表面的共价连接。

羧基活化可从pH 5.0–6.0的MES缓冲液开展筛选，活化约15分钟后及时去除过量EDC，并尽快加入目标蛋白。活性酯在水相中容易水解，活化后等待时间过长会明显降低偶联效率。反应阶段还应避免使用Tris、甘氨酸等含游离氨基的缓冲液，减少竞争反应。

实验可设置不同DSPE-PEG-COOH摩尔比例、EDC/Sulfo-NHS用量及蛋白投料浓度，通过ELISA、BCA、SDS-PAGE检测蛋白结合量，并结合DLS、PDI和Zeta电位评价脂质体稳定性。对于抗体及其他构象敏感蛋白，还需要检测偶联后的受体结合活性。

二、西安瑞禧生物能提供哪些羧基活化优化及蛋白修饰脂质体定制？

西安瑞禧生物可提供DSPE-PEG2000-COOH、DSPE-PEG-NHS及相关功能化PEG磷脂，并围绕羧基活化、蛋白偶联、脂质体表面修饰和靶向纳米载体制备开展科研定制。

针对DSPE-PEG-COOH活化后偶联效率偏低、蛋白负载量不足、纯化损失及脂质体聚集等问题，可根据PEG分子量、表面羧基密度、蛋白结构和反应位点设计不同活化与偶联条件。

相关定制包括羧基PEG磷脂修饰、蛋白及抗体功能化脂质体、链霉亲和素固定和荧光标记纳米载体。可结合偶联率、粒径、PDI、蛋白活性及细胞摄取等指标筛选适宜配方。

三、真实论文如何验证DSPE-PEG-COOH蛋白偶联效果？

2017年发表的研究《PEGylated-nanoliposomal clusterin for amyloidogenic light chain-induced endothelial dysfunction》，采用DSPE-PEG2000-COOH构建羧基功能化纳米脂质体，通过EDC/Sulfo-NHS偶联Clusterin（CLU）蛋白。

研究采用磷脂酰胆碱、胆固醇和DSPE-PEG-COOH构建纳米脂质体，三者摩尔比为70:25:5。通过PEG末端羧基与CLU蛋白氨基形成共价连接，获得CLU修饰脂质体。

实验使用等密度离心分离游离蛋白，再通过ELISA测定未结合CLU含量，间接计算得到99.4%的蛋白偶联率。蛋白修饰脂质体平均粒径为128.8±1.1 nm，PDI为0.23±0.005，Zeta电位为−10.04±0.83 mV。

图1：CLU蛋白、PEG功能化纳米脂质体及CLU偶联脂质体的原子力显微镜形貌和高度分析

2020年发表于Pharmaceutics的研究《Conjugation of Native-Like HIV-1 Envelope Trimers onto Liposomes Using EDC/Sulfo-NHS Chemistry: Requirements and Limitations》，进一步验证了羧基活化后等待时间对蛋白偶联效率的影响。

研究发现，活化并纯化后立即加入蛋白，偶联效率约为40%–60%；等待2小时后明显下降，等待6小时后降低至15%以下。实验还发现，反应pH会同时影响偶联效率和蛋白构象活性，需要根据蛋白性质平衡两项指标。

上述研究说明，DSPE-PEG-COOH表面羧基含量、NHS活性酯稳定性及蛋白反应条件共同决定偶联表现。99.4%的偶联率属于特定CLU脂质体体系，其他蛋白需要独立开展偶联效率和功能验证。

参考文献

1. PEGylated-nanoliposomal clusterin for amyloidogenic light chain-induced endothelial dysfunction. 2017.

DOI：https://doi.org/10.1080/08982104.2016.1274756

2. Conjugation of Native-Like HIV-1 Envelope Trimers onto Liposomes Using EDC/Sulfo-NHS Chemistry: Requirements and Limitations. Pharmaceutics. 2020;12(10):979.

DOI：https://doi.org/10.3390/pharmaceutics12100979