KLH蛋白和多肽通过SMCC偶连实验记录-BS3/SPDP/DSS

SMCC是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂.可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起。该交联试剂可渗透到细胞膜的脂质双层中，NHS活性酯与伯胺在PH7-9的环境形成酰胺键。马来酰胺与巯基在PH6.5-7.5的环境下形成稳定的硫醚键。在水溶液中，NHS活性酯的水解是（与氨基的反应）个竞争反应。马来酰胺比NHS稳定，但是在PH大于7.5时，马来酰胺会慢慢水解，失去与巯基反应的特异性。因而，在使用SMCC时通常是在PH7.2-7.5的环境下进行，并且先让NHS发生反应。

SMCC结构里的环己烷环可以降低马来酰胺的水解速率。这使得蛋白质在用SMCC修饰之后可以冻干存放一段时间。很多蛋白质都选用该试剂来进行马来酰亚胺修饰。

KLH (Keyhole LimpetHemocyanin)，即血蓝蛋白，是在某些软体动物、节肢动物(蜘蛛和甲壳虫)的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。其分子量45０ ０00～１30 000。由于KLH比BSA有更高的免疫原性，因而是最常被选用的载体蛋白。

用SMCC来制备抗体-酶或者半抗原作载体的蛋白质，经常采用两步合成法。首先，含有氨基的蛋白质与几倍的偶联剂反应，反应结束后通过脱盐柱或者透析的方法除掉没有反应完的SMCC。然后，再与含有巯基的蛋白质反应。在实际操作中要注意的是，SMCC怕潮湿，存放时要和干燥剂一起存放。并且使用中从冰箱拿出来时要先在室外放置一段时间平衡温度，以免立刻开启，空气中水分遇冷凝结，破坏SMCC 结构。

1、  将 20 mgSMCC（这是联接40条多肽的量）溶于2 ml DMF。

2、  将0.8 mlKLH加入到25 ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)使蛋白终浓度为15 mg/ml。

3、  将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH 蛋白体系中，室温搅拌反应1h。

4、  用1 L1×PBS (PH 7.4) 溶液于4℃下透析 6 小时，除去游离的SMCC。

5、  将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5 mg KLH-SMCC溶液转移到5 ml离心管中。
例如：反应前加入KLH蛋白的量为120 mg，透析后的KLH蛋白体积为20ml，那么透析后的KLH蛋白浓                                                     μlKLH-SMCC溶液转移到5 ml离心管中。

6、  将 3.0 mg多肽用 0.6 ml 1×PBS (pH 7.2) 溶液溶解。
注意：这里多称量出0.5 mg多肽是用来做ELISA检测的，取出100μl即可。检测多肽随交联好的抗原一起寄出，浓度为5 mg/ml。

7、  用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μl Ellman试剂储备液，再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度计在λ=412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做      下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。
Ellman试剂是用来检测游离巯基的，如果检测液显黄色说明多肽的Cys的巯基大部分以游离态存在；如果检测液不显黄色则说明多肽Cys中的巯基已经被氧化形成二聚体或多聚体。

8、  将多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。

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产品列表：

Sulfo-NHS，N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，CAS#: 106627-54-7

Biotin-ONP，(+)-生物素-4-硝基苯酯，CAS#: 33755-53-2

Biotin-PFP，五氟苯酚生物素酯/生物素五氟苯酯，CAS#:120550-35-8

6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯，CAS#:55750-63-5

6-Maleimidohexanoic acid，CAS#：55750-53-3

N-Maleoyl-β-alanine（MPA），CAS#：7423-55-4

4-Maleimidobutyric acid（MBA），CAS#：57078-98-5

11-马来酰亚胺十一烷酸 N-琥珀酰亚胺酯，CAS#：87981-04-2

2-马来酰亚胺基乙酸，CAS#：25021-08-3

11-Maleimidoundecanoic acid（KMUA）CAS#：57079-01-3

Sulfo-EMCS, ε-马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯  CAS#：215312-86-0

AMAS, CAS#：55750-61-3

1,2-Bis(maleimido)ethane, CAS#：5132-30-9

Boc-6-Ahx-OSu, CAS#：51513-80-5

N-Boc-2,2-(ethylenedioxy)diethylamine ,CAS#：153086-78-3

N,N,N,N-Tetramethyl-p-phenylenediamine,CAS#：100-22-1

N-Succinimidyl 6-Biotinamidohexanoate, CAS#：72040-63-2

N-(+)-Biotinyl-6-aminohexanoic acid  CAS#：72040-64-3

CAS#：127062-22-0

DTSSP

BS3  CAS#: 82436-77-9

BS2G

BSG             CAS#: 79642-50-5

DSP        CAS#: 57757-57-0

DSS        CAS#: 68528-80-3

DTSSP    CAS#: 81069-02-5

EGS       CAS#: 70539-42-3

Sulfo-EGS    

DSSeb    CAS# 23024-29-5

BMPS     CAS#: 55750-62-4

EMCS     CAS#: 55750-63-5

GMBS    CAS#: 80307-12-6

LC-SPDP      

MBS       CAS#: 58626-38-3

PDPH           

SBA       CAS#: 42014-51-7

SIA        CAS#: 39028-27-8

SMCC     CAS#: 64987-85-5

SMPB     CAS#: 79886-55-8

SMPH    

SPDP      CAS#: 68181-17-9

Sulfo-LC-SPDP    

Sulfo-MBS

Sulfo-SANPAH            CAS #: 102568-43-4

Sulfo-SMCC                 CAS#: 92921-24-9

Biotin Hydrazide           CAS #: 66640-86-6

NHS-Biotin                  CAS#: 35013-72-0

NHS-SS-Biotin             CAS #: 142439-92-7

Sulfo-NHS-Biotin

HPG                            CAS#: 24645-80-5

SATA                           CAS#: 76931-93-6

Sulfo-NHS Acetate        CAS #: 152305-87-8

Biotin-maleimide         

Biotin ethylenediamine hydrobromide  CAS# 216299-38-6

Biotinamidohexanoic acid hydrazide     CAS#: 109276-34-8

CAS#: 89889-52-1

TSAT

BMPH           CAS#:359436-61-6

EMCH           CAS#:151038-94-7

KMUH           CAS#:1593661-78-9

BMOE           CAS:5132-30-9

BMB              CAS#:28537-70-4

BMH (bismaleimidohexane)         CAS#:4856-87-5

TMEA

DTME           CAS#:71865-37-7

SATP             CAS#:84271-78-3

EMCA           CAS:55750-53-3

AEDP           

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