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高效深层组织高分辨率动态NIR-II荧光成像研究

时间:2021-09-23 09:36:28       浏览:311

本文成功合成一种新型小分子荧光探针FD-1080,该探针引入磺基和环己烯基团以提高其水溶性和稳定性,在NIR-II区同时具有激发和发射功能,可用于体内成像。FD-1080的量子产率为0.31%,与胎牛血清(FBS)结合后可提高至5.94%。与之前报道的650 nm至980 nm的NIR激发相比,1064 nm NIR-II激发具有更高的组织穿透深度和卓越的成像分辨率。FD-1080不仅能够实现无创高分辨率深部组织后肢血管和脑血管生物成像,还能够用于肝脏呼吸头尾运动动态成像对清醒和麻醉小鼠的呼吸频率进行量化。

前言

确定疾病的正确预后和治疗选择需要准确的生物医学成像方法。其中,断层成像技术因其穿透深度不受限制的优势而发挥着重要作用。然而,它们仍然空间分辨率有限和无法可视化实时动态。基于光致发光的生物医学成像具有反馈快、灵敏度高和分辨率高的优点,但受到组织穿透深度低的限制。二近红外窗口(NIR-II,1000-1700 nm)由于与可见光(400-700 nm)和传统的第一近红外(NIR-I,700-900 nm)相比,在生物组织中具有更深的穿透力(~5-20 mm)而备受关注。到目前为止,无机NIR-II造影剂包括量子点(QDs)、单壁碳纳米管(SWNTs)和稀土掺杂下转换纳米粒子(DCNPs)已被建立用于体内成像。由于未知的长期毒性问题,开发有机小分子NIR-II染料以促进FDA批准和临床转化是可取的。有机近红外染料亚甲基蓝(MB)和吲哚菁绿(ICG)都可以快速排出体外,但是体内成像穿透深度有限。到目前为止,只有少数有机分子在NIR-II区域产生荧光发射,所有这些都是高度疏水的、不溶于水的花青或噻嘧啶染料,它必须封装在聚合物基质中进行生物成像,增加的粒径超过肾脏过滤阈值(~40kD)。最近报道了一种高水溶性小分子CH1055的NIR-II有机染料在在808 nm激发下,在~1055 nm处发射。虽然这种小分子染料在临床前显示出良好的前景,但对制备工艺简单、量子产率高和高分辨率成像质量的NIR-II有机染料的研究是仍处于起步阶段。几乎所有先前报道的NIR-II发射染料都在NIR-I区域(650 nm~900 nm)中被激发。

组织穿透深度一般取决于激发光和发射光的吸收和散射。根据提出的理论模型:δ=[3μa(μa+μs’)]-1/2,,其中μa是光吸收消光系数这取决于波长,μs'(~λ-w)是减少的散射系数,δ是由此产生的穿透深度。指数(w)取决于组织中散射体的大小和浓度以及范围从0.22到1.68对于不同的组织。根据这个模型,可以推测组织穿透深度和成像分辨率将通过激发波长从NIR-I到NIR-II的红移而提高,因为散射减少系数μs'对产生的穿透深度δ的作用比吸收消光系数μa重要得多。因此,开发一种具有优化NIR-II激发的新型NIR-II染料对于有效的生物成像至关重要。我们报道了一种新型小分子有机染料FD-1080的合理设计,具有最大激发和发射波长分别为1064 nm和1080 nm。FD-1080表现出高水溶性和0.76 kDa的小分子质量,完全在肾脏排泄的约40 kDa的大小限制内。与临床批准的NIR-IICG染料相比,FD-1080在连续激光照射下显示出优异的光稳定性。FD-1080的量子产率为0.31%,与胎牛血清(FBS)结合后可提高至5.94%。与650 nm至980 nm的NIR激发相比,1064 nm NIR-II激发具有更高的组织穿透深度和卓越的成像分辨率。实现了左后肢脉管系统、腹部和脑血管的深层组织和高分辨率体内成像,允许穿透完整的皮肤、组织和颅骨。我们在1064 nm NIR-II激发下对FD-1080进行了视频速率(每秒7.16帧)NIR-II光学动态成像,以量化小鼠的呼吸频率。两个磺酸基团被引入吲哚环以获得更高的水溶性。同时,由于共轭次甲基链被环己烯硬化,保证了高稳定性。FD-1080在PBS(pH7.0)溶液中的吸收光谱在1046和810 nm处显示两个峰。FD-1080在1064 nm激发下的荧光发射光谱在1080 nm附近显示出强烈的NIR-II发射峰。FD-1080的量子产率确定为0.31%乙醇溶液。FD-1080的荧光在血清蛋白存在的情况下变得非常明亮。将FBS添加到FD-1080中,在40℃下具有不同的孵育时间,导致810 nm处的吸收减少,同时在1046 nm处增加。孵育超过110分钟后,FD-1080-FBS复合物可以通过FD-1080在位于FBS蛋白质内部的疏水结构域的亲和相互作用达到平衡。在1064 nm激发下观察到明亮的荧光,量子产率约为5.94%。恢复到室温后,与未加热的溶液相比,热稳定的染料-蛋白质复合物保持了更高的亮度。有机染料之间的相互作用由大,疏水性π系统和血浆蛋白是发出明亮荧光染料的途径,主要是由于聚集体受到蛋白质结合的阻碍,并且可以保持刚性染料构象以最小化扭转并因此最小化非辐射衰减。随着热量的增加,略微加热处理放大这些效果增加的热能量允许访问通常难以接近的疏水性结构域。

添加阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)代替FBS后,FD1080的1064 nm吸收和1080 nm发射逐渐增加,进一步表明花青染料可以进入胶束的疏水口袋,导致单体比和分子刚性增加添加阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)代替FBS后,FD1080~1064 nm吸收和1080 nm发射逐渐增加,进一步表明花青染料可以进入胶束的疏水口袋,导致单体比和分子刚性增加。在研究FD-1080染料的成像性能之前,我们首先研究了655~1064 nm不同激发波长对体模(水中1%Intralipid以模拟生物软组织)和生物体的散射和穿透效应。使用带有InGaAs相机的自制仪器的硬组织(裸鼠头骨))。随着激发波长从655 nm增加到1064 nm,观察到更深的穿透深度和更好的体模和硬组织分辨率,表明激发波长是光学成像的重要因素。通过考虑测量的散射系数,观察到的体模成像的波长依赖性合理化对1%Intralipid和裸鼠头骨的波长。曲线显示光子散射与波长成反比,这与我们的结果一致。由于FD-1080从600到1100 nm的吸收光谱很宽,我们可以进一步评估NIR-II激发与从650到980 nm的传统NIR激发相比用于光学成像的性能。为了能够在不同激发波长之间进行并排比较,FD-1080在不同波长下的不同吸收强度在检测前通过InGaAs相机图像软件校准到相同。当填充有FD-1080溶液的毛细管以增加的体模深度浸入Intralipid溶液中时,随着激发波长从655 nm增加到1064 nm,光子的散射减弱,这解决了锐边即使浸入深度为5毫米。随着穿透深度的增加,半峰全宽(FWHM)在被1064 nm激发时显示出更好的成像精度。

为了研究激发波长对体内光学成像性能的影响,在静脉注射FD-1080-FBS复合溶液后,对小鼠左后肢血管和腹部血管进行生物成像,激发波长从655 nm到1064 nm。由于组织的光吸收、散射和自发荧光较少,1064 nm NIR-II激发下的左后肢血管成像性能优于具有较短激发波长的成像性能。不同激发波长(Iex/I808)的发射强度比从1.23(I860/I808)增加到22.83(I1064/I808)。同时,我们评估了成像后肢血管的信号背景比(SBR)。与其他较短波长激发(1.9至2.2)相比,1064 nm激发获得了更高的SBR(4.32))。并且通过1064 nm NIR-II激发的光学成像解析的血管显示FWHM为0.47mm。此外,包括下腹壁在内的整个腹部血管可以在1064 nm激发下以高分辨率清晰成像。


我们进一步研究了FD-1080与NIR-II激发对健康小鼠的非侵入性体内脑血管成像的成像性能。小鼠头部通过头皮和颅骨(颅骨)成像,无需开颅。与通过较短波长(<980 nm)激发成像的模糊脉管系统相比,通过1064 nmNIR-II激发发现了最清晰和最高分辨率的脑血管图像。通过测量特征横截面强度分布的FWHM,我们发现使用808 nm激发和1064 nm成像的同一上矢状窦血管的表观宽度分别为1.43mm和0.65mm,分别表明在较长波长的激发窗口。

由1064 nm NIR-II激发光学成像在小鼠头部解析的最小血管显示宽度(FWHM)为0.34 mm。裸鼠脑血管的激发波长依赖性成像可以通过头皮皮肤和颅骨的消光光谱来解释,两者都具有通过激发波长从NIR-I到NIR-II的红移而导致光子散射分布下降的特征。我们探索了FD-1080在1064 nm NIR-II激发下的体内深部组织动态生物成像。将FD-1080静脉注射到清醒和麻醉的小鼠体内后,我们进行了视频速率(每秒7.16帧)NIR-II光学成像。我们可以根据肝脏的呼吸头尾运动来量化呼吸频率。检测到清醒小鼠的呼吸频率为124次呼吸-1,麻醉小鼠的呼吸频率为71次呼吸-1。虽然无接触无创之前已经报道了NIR-IIQD的深部组织动态生物成像,这是第一次使用有机染料FD1080实现对清醒和不受干扰的小鼠的非接触非侵入性生理成像,具有类似的功能。临床批准的ICG结构,这将促进FDA的批准和临床转化。

结论

本文开发了一种有机小分子染料FD-1080,具有1064 nm NIR-II激发特性、优异的水溶性、高量子产率和高稳定性。与较短波长(<980 nm)激发相比,由于减少了组织散射,NIR-II激发可以实现更深的穿透深度和更高分辨率的体内成像性能。

参考文献

An Efficient 1064 nm NIR-II Excitation Fluorescent Molecular Dye for Deep-Tissue High-Resolution Dynamic Bioimaging,Benhao Li,Lingfei Lu,Mengyao Zhao,Zuhai Lei,Prof. Fan Zhang,Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 7219–7223. DOI:10.1002/anie.201801226https://doi.org/10.1002/anie.201801226

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有机小分子染料FD-1080

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