由于壳聚糖的高分子特性，其水溶性差，只能在酸性水溶液中溶解，叶酸又无法溶于酸性水溶液，所以，采用先将壳聚糖与DMSO中的叶酸偶联，后进行荧光标记及采用离子交联反应法制备纳米粒的方法，用异硫氰酸荧光素标记壳聚糖和叶酸偶联壳聚糖。

荧光标记的叶酸壳聚糖纳米粒的制备：称取10 mg异硫氰酸荧光素(FITC),溶于10mL无水乙醇中，在磁力搅拌条件下逐滴加入到20mL叶酸-壳聚糖的醋酸溶液中，避光反应4 h,使FITC上的碳原子与壳聚糖上的氨基反应以便进行标记。用10mol/LNaOH调节pH值至9。离心用蒸馏水洗涤，直至滤液澄清呈无色为止。将沉淀重新用2%醋酸溶液溶解，用10 mol/L NaOH调节pH值至5，在磁力搅拌条件下逐滴加入10mL TPP溶液(2g/L)。反应20min后得到荧光标记的叶酸-壳聚糖纳米粒"1。

采用红外光谱仪分析叶酸与壳聚糖的偶联情况。如上图所示，叶酸偶联壳聚糖的红外光谱。从叶酸偶联壳聚糖的红外光谱可以看出：NH2在1640 cm处的吸收峰和COOH在1692 cm~处的吸收峰消失，在1562 cm处出现了新的强吸收峰，说明壳聚糖上的氨基与叶酸上的羧基形成了酰胺键,两者成功偶联。

荧光标记的叶酸-壳聚糖纳米粒的颗粒粒径比较集中，无颗粒团聚现象,平均粒径约为290nm。荧光标记的叶酸-壳聚糖纳米粒的原子力显微镜扫描像。可见:其颗粒形态规则，颗粒大小比较均匀，无颗粒团聚现象。此次完善了叶酸修饰壳聚糖纳米载体的制备工艺，为后续靶向性纳米制剂的研制提供了技术手段。

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