使用BDP 581/591染料通过流式细胞术对活细胞进行实验的一般建议：

以下建议是根据NS0细胞的实验结果制定的。建议为细胞类型和当前任务确定染料，ROS诱导剂，抗氧化剂和实验条件的最佳浓度。

1.可以使用悬浮液和贴壁细胞培养物。细胞应在完整的培养基中生长，但与染料，ROS诱导剂和PBS中的抗氧化剂一起孵育。

2. 强烈建议包括阳性和阴性对照

✔ TBHP*（过氧化氢叔丁酯，ROS诱导剂）可用作阳性对照。

✔ 用抗氧化剂（α生育酚或丁基化羟基甲苯**）预处理的细胞在用TBHP处理后可用作阴性对照。

3. 用于ROS检测的BDP 581/591染料的推荐终浓度为5μM或更高。

4. 孵育 30 分钟足以用 BDP581/591 染料染色。

5. 在FL1通道中测量荧光（使用530/30 BP滤光片）

*或者，过氧化氢（H2O2） 可以使用。

**不推荐将NAC（N-乙酰基-L-半胱氨酸）作为抗氧化剂，因为它在BDP581/591染料的几个系列实验中没有显示出抗氧化作用。

使用 BDP 581/591 染料进行 ROS 检测的应用实例

该实验是在NS0细胞上进行的。NS0悬浮培养是一种源自小鼠骨髓瘤的模型细胞系，用于生物医学研究。细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。

✔ ROS 诱导剂：TBHP（过氧化氢叔丁酯）

✔ 抗氧化剂：α-生育酚、丁基化羟基甲苯

✔ 检测：BDP 581/591 羧酸，CellROX 橙色试剂（用于比较目的）

通过将α-生育酚（3.2mg）溶解在96%（0.5mL）乙醇中来制备α-生育酚（15mM）的溶液。

通过将丁基化羟基甲苯（900μg）溶解在96%（1mL）乙醇中来制备丁基化羟基甲苯（4mM）的溶液。

通过将BDP 581/591羧酸（40mg）溶解在DMSO（1 mL）中来制备BDP 581/591羧酸（100 mM）的溶液。从该储备溶液中，取出体积为2.5μL的样品，并在去离子无菌水（1mL）中稀释，以制备浓度为250μM的溶液。

1.通过离心（800g持续8分钟）收集细胞，重悬于预热的PBS（0.5mL）中并分成样品（每个样品30万个细胞）。

2.制备了以下样品：

•抗氧化剂#1：将α生育酚（5μL，15mM）加入样品（细胞悬浮液，30万个细胞）（最终浓度150μM）。

•抗氧化剂#2：将丁基化的羟基甲苯（1μL，4mM）加入样品（细胞悬浮液，30万个细胞）（最终浓度8μM）。

将细胞与抗氧化剂在+37ºС下孵育1小时。接下来加入TBHP（2μL，50mM）（最终浓度200μM），并将样品在+37ºС下孵育30分钟。

•ROS诱导剂：加入TBHP（2μL，50mM）（最终浓度为200μM），并将样品在+37ºС下孵育30分钟。

3. 样品用荧光团处理：

•将BDP 581/591羧酸（10μL，250μM）加入样品中（最终浓度为5μM）。

•将CellROX橙色试剂（1μL，250μM）加入到样品中（新鲜溶液，最终浓度为500nM）。

4. 将所有样品在+37ºС下孵育30分钟。

5. 流式细胞术使用BD FACSCalibur（BD Biosciences）分析仪进行。使用以下带通（BP）滤光片配置的对数扩增标度：488 nm激发线，FL1（530/30 BP用于收集BDP 581/591荧光信号）和FL2（585/42 BP用于收集CellROX橙色荧光信号）。典型的运行使用具有约10，000个细胞的样品。

将细胞置于正向（FS）和侧散射（SS）点图上，随后分析BDP 581/591试剂和CellROX橙试剂的中位荧光强度。

BDP 581/591其他衍生物：

BODIPY 581/591-alkyne氟化硼二吡咯581/591炔烃

BODIPY 581/591-amine氟化硼二吡咯581/591-氨基

BODIPY 581/591-carboxylic acid氟化硼二吡咯581/591-羧基

BODIPY 581/591-NHS ester氟化硼二吡咯581/591-NHS ester

BODIPY 581/591-azide氟化硼二吡咯581/591-叠氮

BODIPY 581/591-hydrazide氟化硼二吡咯581/591-酰胫

BODIPY 581/591-maleimide氟化硼二吡咯581/591-马来酰亚胺

BODIPY 581/591-tetrazine氟化硼二吡咯581/591-四嗪

BODIPY 581/591-DBCO氟化硼二吡咯581/591-DBCO

BODIPY偶联物：

氟化聚多肽纳米颗粒负载光敏剂(BODIPY-2Br)

三苯基膦(TPP)负载碘化光敏剂(BDPI)纳米颗粒(PBDPI-TPP)

1,3,5,7-四甲基-4-苯基-(4-碘乙配胺)-BODIPY(TMPAB-I)

3，5-二芳基乙烯共轭BODIPY染料

3，5二苯乙烯基BODIPY染料

炔基修饰BODIPY染料

呋喃偶联BODIPY染料

噻吩偶联BODIPY并环产物染料

蒽基修饰BODIPY染料

寡聚噻吩修饰BODIPY染料

aza-BODIPY-Br2

噻吩并环BODIPY荧光染料

芳香醛修饰BODIPY染料

吡啶修饰Aza-BODIPY染料

8-羟基喹啉基团修饰BODIPY染料荧光探针

烷基胺修饰BODIPY染料

二苯乙烯基 BODIPY 衍生物

寡核苷酸（乙二醇）醚基修饰BODIPY染料

荧光分子探针TEG-DMA-Aza-BODIPY

荧光探针DCMA-Aza-BODIPY

荧光探针BODIPY-diONs

硫醇荧光探针Cz-BODIPY NBD

NBD荧光团修饰氮杂BODIPY