DiO是一种亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构进入细胞膜后，DiO在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，DiO被激发后可以发出绿色的荧光，具有很高的淬灭常数和激发态寿命。可以用标准的 FITC滤光片检测。

DiO通常不会明显影响细胞的生存力(viability)，因此被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(long-term tracer)。除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移，通过FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)检测脂在细胞膜上的扩散，标记脂蛋白等。下面和瑞禧生物小编一起来看看一种细胞膜绿色荧光探针的操作步骤：

染色液制备：

配置DMSO或EtOH 储存液：储存液用 DMSO或EtOH配置浓度1～5 mM。

注意：未使用的储存液保存在-20℃，分装保存，避免反复冻融。

工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储存液，配制浓度为1～5 μM的工作液。

注意：工作液最终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可从推荐浓度的十倍以上找最佳条件。

悬浮细胞染色：

悬浮细胞密度为 1 × 106/mL加入到工作液中。

在37 ℃培养细胞 2～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。

染色细胞试管在1000～1500转离心5分钟。

倾倒上清液，再次缓慢加入预温37℃的培养液。

粘壁细胞的染色：

使粘壁的细胞在无菌实验室培养。

从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。

在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。

在37 ℃培养细胞 2～20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。

吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，培养5～10分钟，然后吸干培养基。

显微镜检测：

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS滤光器的选择。

多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定： 

a) DiI和DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；

b) DiI和DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；

c) DiI，DiO和DiD＝Omega XF93，Chroma 61005

流式细胞仪检测：

染色的细胞可以分别用经典的FL1，FL2，FL3和FL4流式细胞仪检测。