抗体生物素标记操作方法（具体操作步骤和方法含数据）

  一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

    蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。

一、试剂和器材：

1、标记反应溶液：0.1M  pH 7.2PBS（0.15M sodium chloride）

NaCl 8.77 g ；Na₂HPO₄·12H₂O 32.3g ；NaH₂PO₄·2H₂O 4.5g；加双蒸水 900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至 7.2，最后定容为 1000mL

2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：称取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量为587），溶解于95 µl 超纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，开瓶前平衡至室温。也可以配置200 nmol/L 储备液：20mg NHS-dPEG4-Biotin溶解于170µlDMSO中，-20℃稳定几个月。

由于NHS-PEG4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以实际称量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入超纯水。

3、超滤管

⑴、Millipore超滤管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，残留体积200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心10min。

⑵、Millipore超滤管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，残留体积80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心5 min。

⑶、Amicon Ultra -0.5ml离心超滤管（Millipore），效果更好，典型的最终浓缩物体积：5-15ul。

二、抗体超滤处理

标记前需要应用截留分子量为50kDa 的超滤柱对抗体进行标记前纯化处理(如果不是抗体，一定要按蛋白分子量来确定超滤柱截留分子量)，以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。

具体操作步骤：

1、 于超滤柱中加入200μl 标记反应溶液，加入500ug 单克隆抗体，混匀。

2、 4℃，6000rpm，离心2min。弃滤液。

3、于超滤柱中加入100μl 标记反应溶液，混匀。4℃，Max 14000×g，2min。

4、 重复步骤2 6到7次。

5、 混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min。

6、 将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，1000×g，2min，收集滤液。

7、 取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。

8、 倒置超滤柱，4℃，6000rpm，2min。收集滤液，与步骤6的滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml （0.25ml）。

三、生物素标记抗体

1、 计算抗体标记需要生物素用量。

    抗体浓度 2 mg/ml时的简要计算：

1mL of 2mg/mLIgG (150,000 MW)需要26 μL of  10mM  NHS-PEG4-Biotin

具体计算方式见附录一（标记生物素计算）

2、 超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室温反应1h。

3、 葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素)：

四、葡聚糖凝胶分离纯化标记抗体操作步骤：

   （一）、试剂：

 1、纯化柱处理液 :100 mmol/L Na0H;

 2、纯化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，每升含0.5g NaN₃ ，8g NaCl;

3、样品洗脱液:同纯化柱平衡液;

4、标记抗体保护液（50×）: 10ml0.01MpH7.2 PBS 中加入0.5g BSA，0.2g NaN3。

（二）、凝胶过滤：

    方法见“凝胶过滤法纯化微量标记蛋白”

五、标记抗体的长期保存方法

    将“标记抗体保护液（50×）”加入到标记抗体溶液中，使BSA终浓度为0.1%，4 ℃或-20 ℃ 保存。

六、数据记录：

抗体浓度：    mg/ml        加入抗体体积：    µl

标记前抗体体积：   µl     加入NHS-PEG4-Biotin体积：    µl

纯化柱规格：  cm ×   cm   凝胶体积：     ml

加入标记抗体体积：   µl        

所有洗脱溶液1ml/管收集，到核酸蛋白检测仪显示出峰后，改为0.5ml/管收集，并记录数据：

附录：

一、标记生物素计算：

   1、不同抗体浓度时，抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率：

     Sulfo-NHS-BiotinMW：589

 2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：

   3、标记生物素计算加入体积计算：

西安瑞禧生物可以提供的定制材料包括有：

dUTP-biotin

Biotin-Ubiquitin

生物素修饰的纳米银探针

生物素化的壳聚糖Bio-CS

星形七臂官能化聚己内酯(CDSPCABCL)

生物素修饰的Pluronic普朗尼克

生物素修饰二茂铁Biotin-Fc

生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体

Biotin-PEG-PLLA-PLL

聚乙二醇-聚乳酸-二丙烯酸酯(PPA)共聚物

Mpeg-b-PCL-b-PPEEA聚乙二醇-聚已内酯-聚（氨乙基乙撑磷酸酯）

PLGA-PPEEA 聚（氨乙基乙撑磷酸酯）-聚乳酸-羟基乙酸共聚物

PTMC-PEG-PTMC

生物素修饰的冬凌草甲素脂质体

叶酸/生物素双配体修饰的壳聚糖材料

FA-CS-g-PSBMA 叶酸-壳聚糖-磺酸甜菜碱

乳糖修饰壳聚糖

乳糖修饰去甲斑蝥素(Lac-NCTD)

去甲斑蝥素壳聚糖纳米粒(NCTD-CS-NPs)

Biotin生物素偶联乳糖

半乳糖化壳聚糖接枝聚乙烯亚胺galactosylatedchitosan-g-PEI

RGD多肽偶联壳聚糖chitosan

半乳糖修饰的巯基化壳聚糖

甘草酸表面修饰壳聚糖GA-chitosan

甲氨喋呤-乳糖酰基壳聚糖MTX-壳聚糖

甲氨蝶呤生物素化壳聚糖纳米粒MTX-Biotin-CS

生物素修饰β2微球蛋白

生物素修饰稀土掺杂无机荧光纳米颗粒

生物素修饰萤火虫荧光素酶

生物素化微细纤维肽修饰IGF-1

生物素修饰水溶性共轭聚合物(PFPNBr-biotin)

BDNF-PEG-biotin

生物素化乙酰普鲁兰多糖

FAM-Biotin,FITC-Biotin绿色荧光标记生物素

Biotin-NHS活化脂修饰生物素

PHEMA-biotin 生物素修饰聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)

PLGA-Biotin 生物素修饰PLGA

Biotin修饰红细胞膜

poly(NIPAAm-co-Ada)

生物素修饰地高辛药物

生物素修饰的多肽RGD

Biotin生物素修饰CdTe量子点

生物素化修饰的聚己内酯(PCL/Biotin)

Biotin-PEG-b-Leu

链霉亲和素化的量子点(streptavidin-QDs)

Prazosin-PEG2000-biotin

生物素(Biotin)表面功能化修饰多壁碳纳米管

Biotin-PEG-PLL-peptide-DOX

PLL-PEG-Biotin

Biotin-PEG-c(RGDyK)

biotin-HWTX-Ⅰ生物素标记蛛神经毒素虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ

ssDNA-Biotin-SA-AuNPs复合物

生物素标记的透明质酸(HA-biotin

PAH-Biotin生物素修饰半胱氨酸

Biotin-Ebselen生物素小分子探针

生物素偶联四氨基卟啉

胆碱磷酰化偶联壳聚糖

Chol-Dex-Biotin 胆固醇偶联葡聚糖修饰生物素

DOTA-Biotin生物素偶联大环配体造影

藻胆蛋白标记生物素Phycobiliprotein-Biotin

藻胆蛋白-链霉亲和素(Streptavidin-phycobiliprotein)

生物素偶联物OVA-ZEN-biotin

生物素(Biotin)偶联的多肽zs6

Biotin-DNA偶联物

鸡卵清白蛋白偶联生物素(Biotin-OVA)

辅酶A-生物素(Coenzyme A-biotin)

FITC标记的转铁蛋白(Tf-FITC)

生物素(biotin)修饰的ddNTP核苷酸

生物素活化的转铁蛋白(Biotin-Tf)

HEMA-biotin-Lys-CD

蛤蚌毒素-生物素偶联物

姜黄素-生物素偶联物

多肽CRGD修饰红细胞膜

生物素偶联胆甾醇化乙二醇壳聚糖

胆固醇-葡聚糖聚醛偶联物(Chol-Dex-CHO)

生物素BIO修饰阿霉素DOX-biotin

生物素修饰药物BIOTIN-Drud

CY3/CY5/CY5.5-Biotin生物素修饰荧光染料