Sulfo CY3-DBCO，CAS:1782950-79-1制备成空心微针递送合成mRNA的文献分享

Sulfo CY3-DBCO（磺酸化CY3-DBCO）

Sulfo CY3-DBCO 是一种水溶性荧光染料，用于铜离子自由的点击化学反应。它结合了Sulfo-CY3（磺酸化Cyanine 3，激发波长550 nm，发射波长570 nm）与DBCO（双环辛炔）功能团，后者可与叠氮类物质进行快速、特异性的 SPAAC 反应（应变促进的叠氮-炔点击反应）。由于其磺酸基团增强了水溶性，Sulfo CY3-DBCO 非常适用于在水性体系中标记蛋白、抗体、核酸和多糖类叠氮修饰物。它在细胞标记、活体成像、生物共轭等研究中具有广泛应用，尤其适合于无需催化剂的生物体系中。

一、基本信息

名称：Sulfo-CY3-DBCO

中文名称：磺酸化CY3-DBCO荧光探针

CAS:1782950-79-1

分子量：889

性状：红色粉末

结构：

应用：

1、细胞标记和成像：将Sulfo-CY3 DBCO与含有叠氮官能团的生物分子共价偶联，然后用于细胞成像实验，可视化特定生物分子的位置和分布。

2、蛋白质-蛋白质相互作用研究：Sulfo-CY3 DBCO可用于标记蛋白质，以研究蛋白质-蛋白质相互作用和信号通路。

3、生物传感：制备分子探针和生物传感器，用于检测生物样本中特定生物分子的存在和浓度变化。

文献：

文章来源：

https://www.cell.com/molecular-therapy-family/nucleic-acids/fulltext/S2162-2531(18)30035-0

文章来源：

https://www.cell.com/molecular-therapy-family/nucleic-acids/fulltext/S2162-2531(18)30035-0

作者：

Sonia Golombek ∙ Martin Pilz ∙ Heidrun Steinle ∙ Efrat Kochba ∙ Yotam Levin ∙ Dominique Lunter ∙ Christian Schlensak ∙ Hans Peter Wende ∙ Meltem Avci-Adali

摘要：

近年来，基于合成mRNA在细胞中生产所需外源蛋白的应用越来越重要。然而，合成mRNA的全身递送可能导致非特异性摄取到不需要的细胞或器官中，从而无法靶向所需的细胞。因此，合成mRNA的局部和靶向递送对于到达所需的细胞类型和组织变得越来越重要。在这项研究中，评估了使用基于中空微针注射的方法进行合成mRNA皮内递送。此外，建立了离体猪皮模型，以分析皮内给药后皮肤中合成的mRNA介导的蛋白质表达。使用该模型，证明了合成mRNA的高效递送，这导致检测到由微量注射的合成mRNA编码的高水平可分泌的人源化Gaussia萤光素酶（hGLuc）蛋白。有趣的是，在没有转染试剂的情况下注射的合成信使核糖核酸也能够进入细胞并导致蛋白质表达。在开始体内实验之前，建立的离体猪皮模型可用于评估皮内递送合成mRNAs后所需蛋白质的成功生产。此外，微针的使用使合成mRNAs能够友好、无痛、高效地输送到真皮中；因此，该方法可用于不同皮肤病的局部治疗以及疫苗接种和免疫治疗。

方法：

合成hGLuc mRNA的Cy3标记

通过无Cu（I）（DBCO）点击化学对合成mRNA进行Cy3标记。首先，在IVT期间将5-叠氮基-C3-UTP掺入合成mRNA中，随后通过与DBCO-Sulfo-Cy3孵育将Cy3与5-叠氮基-C3-UTPs结合。因此，在IVT期间，使用1.9 mM 5-叠氮基-C3-UTP（德国耶拿市耶拿生物科学公司）和5.6 mM伪UTP代替7.5 mM假UTP。根据制造商的说明，使用RNeasy MinElute净化试剂盒（QIAGEN）纯化IVT反应混合物。随后，在37°C下，将5-叠氮-C3-UTP修饰的mRNA与总量为5倍摩尔过量的DBCO-Sulfo-Cy3（Jena Bioscience）一起孵育1小时，用无核酸酶的水调节。使用数据表计算DBCO-Sulfoo-Cy3的摩尔量与叠氮标记的mRNA的量的关系。使用RNeasy MinElute净化试剂盒（QIAGEN）再次纯化反应混合物，通过1%琼脂糖凝胶电泳和在室温（RT）下用1×GelRed在三硼酸EDTA（TBE）中染色30分钟来验证mRNA的纯度。使用光度计测定浓度，并将mRNA储存在-80°C下。

结论：

Synthesis of hGLuc-Encoding mRNA and Labeling with Cy3

hGLuc编码mRNA的合成及Cy3标记

此外，为了能够在皮内递送后检测合成的 mRNA，使用无 Cu(I) 的叠氮化物-二苄基环辛炔 (DBCO) 点击化学将 hGLuc mRNA 标记为 Cy3，其中 Cy3 分子在IVT后与合成 mRNA 中掺入的 5-叠氮基-C 3 -尿苷三磷酸 (UTP) 结合。在图 1 B 中，使用紫外透射仪可以清晰地看到 Cy3 标记的 mRNA 带。在约 900 个碱基长度处检测到*强的荧光信号。然而，还可以看到另外两个在 1.5 和 2 kb 处的弱带。出现多个 Cy3 标记带的原因可能是结合的 Cy3 分子的数量。每个 mRNA 的 Cy3 分子数量越多，分子量就越大。未加Cy3标记的mRNA经GelRed染色后可清晰检测到，且与强度*高的Cy3标记的hGLuc mRNA处于同一高度。

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