CY3标记的高铁血红蛋白，Cy3-labeled的合成及纯化过程

CY3标记的高铁血红蛋白（Cy3-labeled Methemoglobin，简称Cy3-MetHb）是一种将高铁状态的血红蛋白与花青类荧光染料CY3通过共价方式偶联所得的荧光蛋白复合物。高铁血红蛋白（MetHb）是血红蛋白的一种氧化形式，其中铁离子处于Fe³⁺状态。与常态Fe²⁺的血红蛋白相比，MetHb无法结合氧，但其蛋白结构依然稳定，常被用于研究蛋白-小分子相互作用、纳米材料负载行为及光学成像探针的开发等方向。

在合成CY3-MetHb之前，需先准备高纯度的MetHb溶液。可将血红蛋白在缓冲条件下用氧化剂（如亚硝酸钠）处理，使Fe²⁺转化为Fe³⁺。反应后通过凝胶过滤去除多余的氧化剂和小分子杂质。MetHb在紫外光谱中呈现典型的Soret带（约为405 nm），便于后续监测反应过程。

接下来，通过将MetHb中的赖氨酸残基氨基与CY3-NHS酯反应实现荧光标记。CY3-NHS酯需先溶解在无水DMSO中，随后缓慢滴加到MetHb溶液中（缓冲液如0.1 M碳酸氢钠，pH 8.3），反应条件需控制在避光、室温下进行1–2小时，以维持染料稳定性。标记比例通常设定为每mol蛋白加入5–10 mol CY3，以避免荧光猝灭或蛋白构象影响。

反应完成后，需对产物进行纯化以去除未反应的游离染料。常用方法包括Sephadex G-25凝胶过滤、离心过滤（透析分子量截断通常为10 kDa）或超滤浓缩。纯化后的Cy3-MetHb呈粉红或橙红色，荧光明显。

表征主要通过以下手段进行：

紫外-可见光谱：检测Soret带（405 nm）及CY3特征吸收峰（550 nm），计算标记比；

荧光发射光谱：确认荧光是否在570 nm左右；

SDS-PAGE胶电泳：评估蛋白完整性及标记均匀性；

质谱或动态光散射（DLS）：分析分子量变化或粒径分布。

状态：固体/粉末/溶液

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