AF488 TCO，Alexa Fluor TCO，英文别名Alexa Fluor488‑TCO、AF488‑trans‑Cyclooctene、TCO‑AF488，中文名称AF488标记反式环辛烯，是将Alexa Fluor488荧光基团与反式环辛烯（TCO）生物正交基团通过连接臂偶联得到的小分子荧光探针，依托逆电子需求狄尔斯‑阿尔德环加成（IEDDA）反应，实现无铜、无催化剂的快速生物分子标记。试剂激发波长495 nm，发射波长519 nm，继承Alexa Fluor488高亮度、抗光漂白、pH不敏感的光学特质，TCO八元环烯烃结构具备很高的反应动力学常数，可与四嗪修饰分子在生理pH条件下毫秒到秒级完成偶联，反应特异性强，不会和细胞内天然生物分子发生副反应，降低非特异性背景信号。

该试剂外观多为浅橙黄色固体，易溶于DMSO、DMF，少量可溶于水相缓冲液，储存条件为‑20℃避光干燥，规避反复冻融，防止TCO基团异构化失活，反式环辛烯在水溶液中会缓慢向顺式结构转化，因此配置工作液建议现配现用，不建议长时间存放水溶液母液。区别于NHS酯、马来酰亚胺这类传统活性标记基团，TCO‑四嗪配对属于预标记后点击偶联模式，研究人员可以先把TCO基团定点修饰到抗体、多肽、重组蛋白、纳米材料表面，纯化除去未反应小分子，后续再加入AF488‑Tetrazine；或是反过来，将四嗪修饰靶向分子导入体系，再加入AF488‑TCO完成荧光标记，两步操作可以分开进行，规避染料活性基团对蛋白活性的破坏，适合对活性敏感的蛋白样本标记。

活细胞原位示踪是该探针的核心应用方向，将TCO修饰的配体导入活细胞，待配体结合细胞膜受体后，加入AF488‑TCO，通过生物正交反应对受体进行荧光标记，追踪受体内吞、胞内转运、蛋白降解全过程，无需透化固定，维持细胞生理状态。在生物材料修饰领域，水凝胶、脂质纳米颗粒、高分子支架表面引入四嗪位点，与AF488‑TCO发生点击反应，完成材料表面荧光功能化，用于观测材料和细胞的相互作用、材料胞内分布情况。在体外分子组装实验中，用于构建荧光标记蛋白复合物，实现蛋白‑蛋白相互作用的荧光成像分析。该探针也适用于生物芯片体系，芯片固相固定四嗪修饰捕获探针，加入AF488‑TCO标记待测分子，读取荧光信号实现分子检测。IEDDA生物正交反应的快速、低干扰特性，让AF488‑TCO成为化学生物学领域分子标记的重要工具，为传统化学标记难以实现的定点标记方案提供可行路径。

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