内容提要

由于颅骨强光衰减和高背景干扰，脑胶质瘤边缘的确认仍然是精确成像和靶向治疗的挑战。近红外二区(NIR II)光声成像(PAI)具有较深的穿透性和较高的灵敏度，在脑胶质瘤成像中具有很大的潜力。本文合成了包裹克酮酸染料A1094的多肽RGD修饰的乙型肝炎病毒核心蛋白(A1094@RGD-HBc)，利用A1094的聚集诱导吸收增强机制（AIAE）用于脑胶质瘤的NIR II PAI。A1094@RGD-HBc具有增强的近红外二区吸收，在体内实现了9倍的PA信号放大，脑胶质瘤的PAI深度可达5.9 mm，同时，¹³¹I标记的A1094@RGD-HBc可以精确共定位获得高分辨率PAI和超灵敏的脑胶质瘤单光子发射断层图像（SPECT），展示其在脑胶质瘤的诊断成像和精确治疗的临床应用上的巨大前景。

前言

脑胶质瘤是世界范围内最致命的颅内恶性**，预后差，死亡率高。目前，影像学检查后的积极手术切除是临床的标准治疗方法。目前的诊断和治疗由于不准确的**位置评估和模糊的手术边缘的大脑。强烈的光衰减和散射在颅骨往往阻碍光穿透，采用光学方法探测大脑深部区域变得困难。因此，迫切需要一种能够准确确认深部脑胶质瘤手术边缘的高灵敏度成像方法。光声成像(PAI)以其单模态的高空间分辨率和丰富的对比度，近年来受到了科学家和医生的广泛关注。这种新技术与有效的PA成像剂是有用的疾病监测，特别是在早期治疗和非侵入性**成像。由于灰质比周围组织(包括肌肉和脂肪组织)表现出更高的散射和更强的吸收，需要高剂量的药物增强成像反差，这可能会导致严重的不良反应或毒性；脑胶质瘤检测和治疗的另一个挑战是如何克服血脑屏障(BBB)将药物输送到**组织。因此发展出安全有效的以胶质瘤为靶点的NIR II强吸收的有机探针对于脑疾病的深层PAI尤为重要。作者报道了π- π共轭的有机分子A1094，在生物相容性载体中聚集时表现出优异的聚集诱导吸收增强(AIAE)，并用于深层PAI(方案1a)，其机理归因于HOMO和LUMO之间的能隙共振增强(方案1b)，增强聚集体的光吸收。本文通过巧妙的设计和分子工程证实了AIAE效应,在适当的浓度范围内，A1094@RGD-HBc的NIR II窗口显示出非线性吸收，并首次应用于深部脑胶质瘤的PAI。

结果与讨论

A1094的HOMO和LUMO轨道能量分别为−4.47和−3.57 eV，近红外吸收的能带隙很小。在图1a中，A1094在1094 nm处有很强的吸收峰（图1a），在乙醇、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂中溶解良好。A1094在不同pH下表现出不同的吸收水平。A1094在酸性pH值(4.1-5.9)中具有较强的吸收能力，这表明A1094适合作为探针用于**酸性微环境成像。在白光或激光照射下，A1094在二氯甲烷中是稳定的。即使浓度低至62.5 µg mL⁻¹DMSO溶液中，A1094的PA性质也表现出较高的检测灵敏度(图1c) 。将A1094被封装到RGD-HBc蛋白中，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot分析证实了RGD-HBc的活性。动态光散射和透射电镜均显示A1094@RGD-HBc的直径在30 nm左右(图1d和1e)。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及在980 nm激光照射下(0.5 W cm⁻²,10 min)， A1094@RGD-HBc的优良光热稳定性。将A1094加载到RGD-HBc蛋白后，在NIR II区明显出现AIAE(图1f)。即使在很低的浓度(25 µg mL⁻¹)下，A1094@RGD-HBc也具有很强的吸收强度，且呈非线性关系。为了进一步说明AIAE的作用机制，我们将A1094@RGD-HBc用DMSO解离，使RGD-HBc蛋白释放出A1094，从而导致NIR II吸收减少而在Oil Red O@RGD-HBc中，未发现AIAE效应。为了研究RGD对人原发性胶质母细胞瘤细胞系(U87MG)的选择性，U87MG细胞分别与RGD-HBc、HBc和PBS孵育。RGD-HBc孵育12 h后，细胞的荧光强度比PBS处理的细胞亮9.6倍，比HBc处理的细胞亮1.6倍(图1g)。共聚焦显微镜结果显示A1094@RGD-HBc比A1094@HBc更特异的细胞摄取(图1h)。

图1. a) A1094在甲醇中的梯度吸收光谱(40-80 µg mL⁻¹)。b) A1094在DMSO 950 nm处不同浓度(0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 mg mL⁻¹)的PA图像。c) DMSO中A1094浓度对PA振幅的影响。d) A1094@RGD-HBc透射电子显微镜。e) A1094@RGD-HBc的动态光散射。f) A1094@RGD-HBc在90% DMSO破坏蛋白前后的吸收光谱。g)流式细胞术分析U87MG细胞与RGD-HBc和HBc孵育后不同时间点的变化。h)用标记为A1094@RGD-HBc和A1094@HBc的Cy5.5孵育U87MG细胞后的荧光图像。

在A1094@RGD-HBc的NIR II区高效的靶向性和高增强的吸收，促使我们进一步探索其在不同波长的吸收(图2 a)。1200-1300 nm处聚集体的PA振幅明显强于800-950 nm处(图2c)，说明AIAE的性能。图2d显示了具有AIAE特性的1200 nm处显著的PA振幅。PA信号在解聚状态下表现出微弱的PA信号，表明增强的PA振幅是由A1094聚集引起的。将A1094@RGD-HBc皮下注射到小鼠皮肤中。在1200 nm左右的激发下检测到优良的PA信号(图2b)，无AIAE特性的对比在体内表现出较低的PA信号。RGD-HBc中A1094的聚集可在体内实现9倍吸收增强，表明其作为深部脑**PAI具有明显优势(图2e)。考虑到在小鼠颅骨中已被证明在1064 nm处相对较弱的光衰减，选择1064 nm进行体内原位脑胶质瘤的PAI。

图2. 探针在800-1400 nm解聚前后的PAI a)体外，b)体内。c) (a)对应PA信号强度。d) PA信号在1200 nm处在150分钟内的稳定性A1094@RGD-HBc。 e) (b)对应PA信号强度。

利用自制的声分辨光声显微镜(AR-PAM，图3 a)，经过低剂量A1094@RGD-HBc(100 µg×mL⁻¹)静脉注射，PA模型监测A1094@ RGD-HBc的积累，超声(US)模型显示**位置(图3b-d)。PA和US的b级扫描显示，**来自脑皮肤的深度为5.9 mm (图3e-g)。由于AIAE的性质，A1094@RGD-HBc的剂量仅为ICG@RGD-HBc的四分之一。

图3。a) AR-PAM系统用于U87MG荷瘤小鼠成像。OPO:光参量振荡器;NDF:中性密度滤波器;M:镜子;HWP:半波板;L:镜头;ConL:凸透镜;BS:分束器;FC:光纤耦合器;帕金森病:光电二极管;CL:锥形透镜;WT:水箱;UPR:超声波脉冲发生器/接收器;DAQ:数据采集卡;PC:个人电脑。b) PA, c) US，和d) U87荷瘤小鼠合并的大脑图像。e) PA, f) US, g)注射后2 h**合并图像对应的b扫描图。

注射后2 h后，伪彩色显示**在1064 nm处增强的PA信号(图4a)，而灰色显示颅骨的共定位图像，A1094@RGD-HBc作为一种有效的脑**PA成像剂。经过¹³¹I标记的 ¹³¹I-A1094@RGD-HBc SPECT/CT图像显示，注射后2小时**放射性摄取增强(图4b)，这与PAI结果一致。成像后，脑组织用于放射自显影研究，并收集主要器官进行H&E染色。与正常脑片相比，**脑片具有较高的放射性摄取，具有良好的特异性(图4c)。结果表明，¹³¹I-A1094@RGD-HBc具有极高的效率、特异性和生物相容性，可作为原位深部脑胶质瘤PAI和超灵敏SPECT成像的理想造影剂。

图4。活体PA/US和microSPECT/CT成像。a) PA/US图像和b) U87MG荷瘤小鼠在注射¹³¹I放射性标记A1094@RGD-HBc后2小时的大脑SPECT/CT图像。c)注射¹³¹I-A1094@RGD-HBc后，对照组(左)和荷瘤组(右)的放射自显像。比例尺= 2毫米。R:吻鼻静脉;S:矢状窦;T:横窦。

结论

本研究利用AIAE机制，克服传统发色团聚集猝灭效应而对成像的不利影响，实现在NIR II窗口对脑深部**PAI的作用。A1094@RGD-HBc在有限的空间封装成蛋白载体后，表现出增强的NIR II吸收和强大的PA造影增强能力，在原位脑深部**成像中具有广阔的应用前景。利用AIAE效应这种光吸收过程来构建合适的吸收聚集体，表现出优异的光稳定性、特异性**靶向性和高效的浓度依赖性吸收，可以将其深度PAI的优势延伸到临床转化。

参考文献

Yajing Liu, Huanhuan Liu, Huixiang Yan, Yingchao Liu, Jinsen Zhang, Wenjun Shan, Puxiang Lai, Honghui Li, Lei Ren, Zijing Li,* and Liming Nie*, Aggregation-Induced Absorption Enhancement for Deep Near-Infrared II Photoacoustic Imaging of Brain Gliomas In Vivo, Adv. Sci. 2019, 6, 1801615. DOI: 10.1002/advs.201801615. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.201801615

产品提供

克酮酸染料A1094

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溶解性：脂溶性 DMSO DMF 等溶解

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