内容提要

光声(PA)成像已经成为一种可靠的体内技术，用于从疾病筛选到分析传感的各种生物医学应用。大多数当代PA显像剂采用NIR-I光(650 - 900 nm)来产生超声信号，然而，内源性生物分子如血红蛋白会产生明显的干扰。向更长的激发波长(即NIR-II)过渡可以减少背景，促进低含量目标分子如NO)的检测。作者采用开发了一种NIR II NO-响应探针APNO-1080，可用于深层组织PA成像。首先，作者进行了Hammett和Brønsted分析，确定一种高度反应性和选择性的苯胺基接受器，通过N-硝化化学与NO反应。在原位乳腺癌模型和异位肺癌模型中评估了APNO-1080在体内的深层组织成像能力。

前言

光声(PA)成像是一种强大的体内技术，利用PA效应将吸收光转换为超声信号。由于临床上相关频率(2 ~ 18 MHz)的声音可以在最小扰动下很容易地通过组织传播，PA成像已成为各种生物医学应用的通用方法。在分析物传感的背景下，多种设计策略已被用于开发声源探针(也称为可活化PA探针)，以选择性地可视化和监测体内不同的成像目标，如检测缺氧、氧化还原状态、酶活性、金属离子、生物硫醇和各种活性氧和氮(ROS/RNS)的光声探针。大多数小分子PA探针设计在NIR-I染料平台上，其吸光度最大值在650 - 900 nm之间。一些内源性的生物分子如血红蛋白、氧血红蛋白、脂质和黑色素在这个区域吸收，导致高背景。除了不良的信号，这些生物发色团衰减入射光，从而限制灵敏度和成像深度。作者报道的第一代NIR光声探针(APNO-5)和第二代NIR光声探针(SR-APNO-3)，它们能在活鼠中检测一氧化氮(NO)，但是均局限于炎症和乳腺癌的皮下模型。在NIR-II区域(>1000 nm)吸收的PA探针可以克服这些限制，提高信噪比，提高灵敏度和更深的组织穿透。本文发展了APNO1080并用于深层组织NO的 NIR-II PA成像。

结果与讨论

通过具有不同取代位的苯胺（对位分别是−Br，−H，−CH₂OH，−Et，−Me，−OEt和−OMe)与Cy7-Cl反应，获得探针1−7(图1a)。相应的Hammett图显示ρ值为−0.94，这与在过渡态积累的适度正电荷特征一致，这是由增加的电子密度促进的(图1b)。从的Brønsted图中观察到苯胺的共轭酸的pKa和反应的初始速率之间有很强的相关性(R²= 0.87，图1c)。探针7在不到30秒的时间内促进了NO的接近完全转化(25°C, 100等量)。作者将接收器连接在三个商用的NIR-II花菁(IR-26、IR-1061和IR-1048)以及Et-108032和FlavV7上合成了8−12个探针(图1d)。该系列的每个化合物都有一个大的消光系数(约为10⁵M⁻¹cm⁻¹)，在近红外II窗口中吸光度最大。但是，这并不是影响PA信号强度的唯一因素。探针8、9和12在缓冲溶液体系中都很难溶解，这导致了较弱的PA信号。探针10和11在水介质中具有清晰明确的光谱特性，并且在照射后具有明显更强的PA信号。当NO过量时， 10和11反应完全。探针10(APNO-1080)能快速转化为N-亚硝化产物，最大吸光度从874 nm转移到1080 nm，红移206 nm(图2a)。APNO-1080及其N-亚硝化产物的连续辐照不会导致任何光氧化或光反硝化作用(图2b)。作者首先检测了APNO-1080 NIR-II光声探针对NO的选择性。在任何情况下，作者都没有观察到任何不希望的探针激活(图2c)。此外，作者进行了一个标准的MTTA549细胞在25 μM浓度下培养24小时无细胞毒性(图2d)。将APNO-1080与富含CYP450酶的大鼠肝微粒体(RLM)在37°C孵育1 h，检测其代谢稳定性。APNO-1080在1080 nm处的吸光度没有增加，说明有RLM存在时APNO-1080是稳定的。

图1. (a)不同NIR-I APNOs(探针1−7)与NO反应生成N-亚硝基产物的示意图。(b) 25℃下对取代APNOs和NO(引入为MAHMA-NONOate)的N-亚硝化反应的Hammett图。虚线表示最佳线性拟合。R² = 0.94。(c) Brønsted图，表示log(k)与每个苯胺的共轭酸形式的pk_a值之间的线性关系。虚线表示最佳线性拟合。R² = 0.87。(d)来自IR-26、IR-1061、IR-1048、Et-1080和Flav7的NIR-II APNOs(探针8−12)的化学结构。

图2. (a) APNO-1080经(红色)和(蓝色)NO处理后的归一化吸收光谱。(b)的耐光性试验APNO-1080或N-nitrosated产品(50 μM)连续与脉冲激光辐照在各自的最大吸收处300秒。(c)反应APNO-1080 (5 μM)与生物相关的金属离子(1 mM),谷胱甘肽(1 mM),半胱氨酸(500 μM),硫化氢(100 μM)、活性氧(1 mM)，活性羰基 (1 mM)，活性氮(1 mM)，ONOO⁻(50 μM)和NO (100 μM)孵育1 h后。(d) 37°C培养24 h后A549细胞毒性。

作者比较了APNO-1080和探针7(APNO-780)的深层组织能力。每个探针的溶液都用NO供体(MAHMA-NONOate)处理以确保完全激活。将得到的产品嵌入由琼脂糖和2%牛奶组成的3厘米厚的模拟组织中，在吸光度最大处成像。APNO-1080可以清晰地观测到，而APNO-780在背景中无法识别(图3b)。当根据波长依赖性的影响差异进行校正时，相当于灵敏度增加了17.7倍(图3c)。两个探针的PA强度相似，表明激发光的穿透增加是导致灵敏度差异的原因。这是一个近似效果，因为模拟的组织缺乏血红蛋白和氧血红蛋白，活体中减弱NIR-I光比NIR-II光更明显(图3a)。

图3. (a)与NIR-I光相比，NIR-II光能更深地穿透组织的示意图。(b) APNO-780和APNO-1080代表性PA图像(10 μM)经NO处理后，覆盖3cm厚组织成像图。(c)量化数据来自(b).误差条= SD (n = 3)采用双尾Student’s t检验(α = 0.05)进行统计分析。****: p < 0.0001。

检测与癌症相关的内源性NO对于理解其在调节**微环境中的作用至关重要。APNO-1080首次应用于原位4T1-Luc乳腺癌模型。与作者之前皮下乳腺癌模型相比，由此产生的原位**可以生长到体内更深处，是评估APNO-1080在体内深层组织成像能力的理想模型。表达荧光素酶的细胞系用来确认植入和跟踪**生长。当**体积增长到约400 mm³时，给药APNO-1080后对动物进行成像，并使用光谱分离来自探针的信号。作者观察到荷瘤小鼠的激活反应为1.3±0.1倍，而无**对照小鼠的激活反应为1.0±0.2倍(图4a,b,e)。我们将A549-Luc2肺癌细胞移植到Nu/J小鼠的肝脏上，模拟肺癌患者的肝转移，并提供更深组织中成像NO的可能性。植入后几周使用生物发光成像检测**，然后通过眼球注射APNO-1080进行PA成像。30分钟后进行实时PA监控，观察到一个明显信号增加**区域。

图4. (a) (b)图像横断面解剖的卡通示意图。(b) 4T1-Luc**的代表性PA图像，以及APNO-1080 (50 μM)治疗后的无**对照。(c) (d) A549-Luc2**的代表性PA图像，以及APNO-1080治疗后的无瘤对照。(e) APNO-1080治疗后4T1-Luc**的PA折叠正常化。(f) APNO-1080治疗后A549**的归一化PA折叠开启(n = 6)和非**对照(n = 3)。错误条= SD。采用双尾Student 's t检验(α = 0.05)进行统计学分析。***: p < 0.001

结论

作者成功地开发了第一个NIR-II光声探针APNO-1080，用于检测深层组织中内源性癌症来源的NO。APNO-1080在NIR-II花菁平台(IR-1048)上具有优化的对甲氧基苯胺接受器。与NO反应后，N-亚硝化产物的消光系数在1080nm处吸收最大，与探针的光谱无重叠，能够灵敏地检测**中稳定浓度在低nM范围内的NO。本研究强调了将PA造影剂和光声探针移至NIR-II窗口以获得更大的成像深度和更高的灵敏度的价值。

参考文献

Melissa Y. Lucero, Amanda K. East, Christopher J. Reinhardt, Adam C. Sedgwick, Shengzhang Su, Michael C. Lee, Jefferson Chan*, Development of NIR-II Photoacoustic Probes Tailored for Deep-Tissue Sensing of Nitric Oxide, J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 7196−7202， DOI：10.1021/jacs.1c03004. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c03004.

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NO近红外1区/2区荧光/光声探针