内容提要

硝酸还原酶(nitreductase, NTR)在缺氧**中可能过表达，因此选择性、高效地检测NTR具有重要意义。虽然已经有一些光学方法用于检测溶液中的NTR，但仍缺乏有效的光学探针来监测体内NTR。因此，本文报道了一种用于NTR的近红外(NIR)荧光检测探针。在5种具有不同硝基芳香基团修饰的荧光报告结构的近红外花菁染料（Cy7-1−Cy7-5）的基础上，筛选出对硝基苯甲酸基修饰的花菁探针(Cy7-1)可以作为NTR的快速近红外荧光增强探针监测和生物成像。理论研究揭示了连接检测和荧光报告基团和硝基位置的连接剂是氢键形成和空间结构匹配的关键因素，诱导NTR催化能力增强。当Cy7-1被NTR催化还原为Cy7-NH₂时，会阻断吸电基团诱导的电子转移过程，表现为检测过程中荧光强度增强。缺氧A549细胞的共聚焦荧光成像证实了Cy7-1在细胞水平的NTR检测能力。Cy7-1可以在小鼠缺氧**模型中检测**缺氧，显示出快速显著增强其适合荧光生物成像的近红外荧光特性。

前言

缺氧是**组织的一个特征，在临床应用中，微血管异常的缺氧**的形成会限制细胞毒性化疗药物在其中的灌注，与常氧**相比，降低其疗效。因此，评估**缺氧程度对预测**疗效具有重要意义。到目前为止，已经发展了几种评估**缺氧程度的方法，如氧压测量法(如氧电极法)、血流速度法(如血氧合水平依赖性磁共振成像(blood - MRI))、缺氧标志物检测法(如硝基还原酶、缺氧诱导因子(HIF)等生物标志物检测具有较高的选择性和敏感性，是缺氧检测的一种重要方法。一般来说，缺氧伴随着还原酶水平的升高，如硝基还原酶(NTR)、二磷酸脱氢酶和偶氮还原酶。在实体瘤中，NTR水平与缺氧程度直接相关。因此，NTR水平的检测可用于评价**缺氧程度。NTR的催化反应，芳香底物与NTR之间由于氢键作用、π−π堆叠作用、疏水效应等相互作用较强，表现出较高的反应活性。底物中的硝基可以先还原为亚硝基，然后再还原为羟胺基，最后还原为氨基。此外，吸电子基团引起电子转移过程，使底物的荧光发射猝灭，NTR还原硝基导致荧光强度的变化，这是NTR检测荧光探针设计的重要策略。文献报告了几种将芳香硝基与可见激发荧光团(如萘酰亚胺、尼罗河蓝和间苯二酚)连接起来的荧光探针，这些探针需要紫外线(UV)或可见光作为激发源，可能对健康细胞和器官造成有害影响。最近，Tang的研究小组报告了一种花菁衍生物作为近红外(NIR)荧光开启探针来检测NTR，但是没有进行体内动物生物成像。因此，开发一种有效的用于体内成像的NTR光学探测探针仍然是一个重大的挑战。作者在5个以硝基芳香基装饰的花菁探针(Cy7-1−Cy7-5， 图1)研究的基础上，系统地研究了Cy7-1在NTR检测中的研究。Cy7-1具有快速响应、超灵敏和激发和发射波长均位于近红外光学窗口。建立其在体外缺氧细胞中检测过表达硝基还原酶的能力，并应用于体内荧光生物成像技术监测**内NTR。

结果与讨论

在本研究中，检测部分和荧光报告单元分别为芳香硝基和花菁结构。为了优化探针结构，我们选择了不同的连接基团和不同的硝基位置来研究探针的构效关系。如图1所示，通过固定对硝基苯基和花菁基，将连接键由−COO变为O和S，得到的探针Cy7-1、Cy7-2和Cy7-3可以看出连接键的影响。然后通过固定酯键连接花菁部分和芳香基团，将硝基从对苯基位置引入邻苯基位置和间苯基位置，得到探针Cy7-2和Cy7-3，并探讨芳香硝基位置的影响。由于芳香硝基具有很强的吸电子性，可以认为这些探针的荧光可以被猝灭。与NTR反应后，硝基被还原，从而抑制了分子内电子转移过程，这对应于花菁的荧光发射恢复。如图1种探针的吸收光谱和荧光发射光谱，在730 nm激发下，除了Cy7-2红移约20 nm外，这些探针显示出类似的近红外发射带。但是，Cy7-1−5在Tris缓冲溶液中的绝对量子产率分别为<0.1%、<0.1%、1.1%、<0.1%和0.3%，表明吸电子基团诱导的电子转移过程抑制了荧光发射。在NADH存在的情况下，添加0.25 μg mL⁻¹NTR时，探针Cy7-2−5的荧光强度没有明显变化，但Cy7-1的荧光强度显著增强了约110倍。为了鉴定NTR还原硝基转化为氨基物质的增强荧光，合成了Cy7-NH₂的还原产物。Cy7-NH₂与Cy7-1具有相似的近红外发射带，但其荧光强度比Cy7-1高2个数量级。质谱/液相色谱进一步证实 Cy7-1在NADH存在下与NTR反应形了Cy7-NH₂。

图1. 五种荧光探针Cy7-1−5的化学结构。Cy7-1−5的紫外-可见吸收光谱(a)和归一化荧光发射光谱(b)在0.05 M Tris缓冲液中，1.5% DMSO为共溶剂，pH = 7.4。

为了深入了解结构与NTR检测能力之间的关系，对Cy7-1−Cy7-5与硝基还原酶进行对接计算。探针分子通过疏水作用和芳香环π-π相互作用趋向于NTR的疏水空隙，然后利用NTR氨基酸残基与Cy7-1的硝基O原子之间的氢键形成过渡态。带有对取代硝基的探针Cy7-1与NTR的Ser12、Ser14、Arg10、Arg11和Arg 172氨基酸残基形成8个氢键。相比之下，Cy7-2−Cy2-5中只有1、2、2和4个氢键形成。我们将Cy7-2，Cy7-3与NTR的相互作用可视化，以研究Cy7-1中连接键−COO基团的影响。Cy7-2和Cy7-3的O原子和S原子与NTR氨基酸残基之间没有形成氢键，而Cy7-1与−COO形成了一个氢键链接器组。此外，Cy7-2或Cy7-3的空间排列与亲水空间匹配不佳，在硝基和氨基酸残基之间只形成了一到两个氢键。与之形成鲜明对比的是，Cy7-1的硝基O原子与NTR的氨基酸残基之间有7个氢键，表明Cy7-1与NTR的空间结构匹配最优。这证明了探测部分与荧光报告部分之间的连接是探针探测部分从疏水空间到亲水空间空间结构匹配的关键因素。将酯连接键固定在探针结构上，通过比较Cy7-4、Cy7-5和Cy7-1含有邻硝基和间硝基的探针和Cy7-1含有对硝基的探针，观察了硝基位置对探针结构的影响。Cy7-4和Cy7-5的硝基O原子和氨基酸残基之间只有2和3个氢键，而Cy7-1的氢键则远远少于7个。我们分析了化学结构，可以发现，Cy7-1、Cy7-4、Cy7-5的硝基O原子与荧光报告菁部分的距离分别为8.33和8.66 Å、4.87和2.76 Å、6.2和7.66 Å。因此，硝基O原子与荧光报告部分之间的距离较长，有利于探针接近NTR亲水部分的氨基酸残基并与之形成强氢键。这一事实也有助于增强Cy7-1的空间结构匹配和NTR催化能力。Cy7-1在检测部分和荧光报告部分之间的连接和硝基位置的重要性，并解释Cy7-1具有极高的反应活性和灵敏度。

图2. Cy7-1 (a, b)、Cy7-2 (c)、Cy7-3 (d)、Cy7-4 (e)、Cy7-5 (f)与NTR结合的计算模型。在(a)中，Cy7-1结构的C、N和O原子分别显示为粉红色、蓝色和红色。在(b - f)中，Cy7-1到Cy7-5的C、N和O原子分别显示为黑色、蓝色和红色。红色曲线表示NTR的疏水区和氨基酸残基。氢键用绿色虚线表示。

如图3b所示，在加入NTR后的1 min内，荧光发射扫描显示出显著的增强，说明对酶的响应非常快。随着NTR浓度的增加，达到最大荧光强度所需的时间逐渐缩短(图3c)。酶浓度的增加提高了其催化能力，加速了含硝基探针对荧光胺的还原。最大荧光强度随着NTR浓度的增加而增加，如图3d所示。这表明光强可以直接反映NTR浓度。在优化的反应条件下(pH≈7.4，温度= 3.7°C)，合成了一种具有较好活性的NTR降低Cy7-1的荧光强度，NTR浓度在0.15~0.45 μg mL⁻¹范围内呈良好的线性关系。检测限为NTR的1.14 ng mL⁻¹。即使在pH 6.0和室温(25℃)的非优化条件下，NTR仍能催化Cy7-1的还原，发射强度在30 s内迅速增强，并在10 min以上继续增强。为了进一步研究Cy7-1的反应选择性，研究了盐(K⁺、Na⁺、Ca²⁺)、氨基酸(酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、精氨酸)、葡萄糖、维生素C、活性氧(H₂O₂、KO₂)、溶菌酶、BSA等潜在干扰物种。在500 μM NADH存在下，将这些潜在干扰物质添加到Cy7-1 (10 μM)中，没有观察到显著的荧光增强。此外，对氧化还原系统中的一些干扰物种如电子转运体(细胞色素b5、细胞色素c)和氧化还原酶(亮氨酸脱氢酶、谷胱甘肽还原酶和甲酸脱氢酶)也具有很高的选择性。

图3. (a−b) Cy7-1 (10 μM)的紫外-可见吸收(a)和荧光(b)光谱扫描与NTR (0.25 μg mL⁻¹)反应。(c)当NTR浓度为0.15 μg mL⁻¹(蓝色)、0.375 μg m L⁻¹(绿色)、0.75 μg m L⁻¹(黄色)、1.5 μg m^L−1(橙色)和不含NTR(红色)时，Cy7-1 (10 μM)的荧光发射强度(λ_ex= 730 nm、λ_em= 782 nm)随时间变化。(d)不同NTR浓度催化Cy7-1 (10 μM)的最大发射强度。

采用MTT法测定Cy7-1对A549细胞系(人肺泡基底上皮细胞)的细胞毒性。Cy7-1在2 ~ 25 μM浓度下孵育6或12 h，细胞存活率为>70%，具有较低的毒性。为了评估Cy7-1在细胞内NTR监测中的适用性，共聚焦荧光显微镜对A549细胞进行了检测，该细胞已知在缺氧条件下表达NTR。A549细胞在常氧条件(20% O₂)和不同缺氧条件(10%、5%、3%和1% O₂)下培养6 h，然后用5 μM Cy7-1处理10分钟。如图4所示，常氧条件下培养的A549细胞显示出非常微弱的近红外荧光信号。然而，A549细胞在低氧浓度下培养时，近红外区域荧光信号增强，说明这些细胞在不同氧浓度下可以表达不同的NTR浓度。表达的NTR可催化还原探针Cy7-1，使其在不同缺氧条件下培养的细胞中荧光强度增加。

图4. Cy7-1 (5 μM)孵育不同氧浓度条件下A549细胞的共聚焦荧光显微镜成像。(a)在近红外通道(780±30 nm， λex= 633 nm半导体激光器)采集荧光成像。(b)合并荧光成像和亮场成像。比例尺= 60 μm。

将Cy7-1在Tris缓冲液中直接注射到活小鼠的A549**中，在730 nm（功率密度为1 mW cm⁻²）连续激发下，收集800±12 nm的信号。为了动态观察Cy7-1在小鼠**内注射前后荧光强度的变化，在小鼠旁边放置装有Cy7-1 (20 μM)的Tris缓冲液管(图5a)。在长期跟踪中，管中的Cy7-1基本上是不发射的。注射Cy7-1后，**区域(d = 12 mm) 2 s内荧光强度显著增强，3 min内注射部位荧光强度达到最高(约8倍)，如图5b, 5c所示。随着追踪时间的延长，荧光强度的增加逐渐从注射部位扩散到整个**区域。如之前证实的，将Cy7-1探针注入**后，**产生的NTR催化将其还原为Cy7-NH₂，使整个**产生荧光，荧光持续时间超过30分钟。为了在体内研究其抑制作用，作者选择双香豆素作为NTR的抑制剂。在**区域注射Cy7-1和双香豆素混合物时，荧光强度的增强程度(5倍)明显低于未注射双香豆素时的增强程度(8倍)。首先将双香豆素注射到**的一半区域，10 min后再注射Cy7-1，进一步抑制了荧光增强。实际上，在注射双香豆素的**区域没有观察到进一步的荧光增加(约0.3倍)，这种抑制进一步证实了NTR在**中催化还原Cy7-1到发射cy7NH₂。

图5. A549**小鼠模型在**内注射Cy7-1 (20 μM, 100 μL)前(a)和(b)后的基于时间的体内荧光成像。(c)注射后0 ~ 180 s, Cy7-1在试管(黑色)和小鼠**区(红色)中的荧光强度变化。在730 nm连续激光(功率密度为1 mW cm−2)激励下，λem= 800±12 nm采集荧光信号。

PET技术已被广泛用于区分缺氧和常氧**，基于¹⁸F-FMISO可以与**过表达NTR的事实。如图6a所示，在A549荷瘤小鼠体内静脉注射¹⁸F-FMISO (300 μCi, 0.9% NaCl水溶液，0.2 mL) 90 min后，在**区域观察到强烈的¹⁸F信号。PET成像完成后，将小鼠解剖。A549**组织(检测样本)和A549**旁的正常组织(对照样本)进行电泳酶检测，迁移的正常A549**的关系(2)是一样的,正常标记(3)关系的SDS−PAGE，酶分子量24 kDa，可比与标准蛋白(4)。相比之下，没有相同的酶或蛋白分子量从正常组织获得(1)。一般情况下，随着**体积的增大，缺氧程度加重，NTR的过表达增多探针Cy7-1也被用来监测NTR在不同大小的A549**(1,d = 7 mm, 2, d = 12 mm)中的过表达程度。如图6b，6c所示，小鼠1 (7 mm**)和小鼠2 (12 mm**)**区域的荧光信号分别增强了3倍和8倍左右。这些明显的荧光增强反映了不同大小**中不同程度的缺氧。因此，Cy7-1为体内监测**NTR过表达和缺氧水平提供了一种潜在的工具。如图9d，我们也得到了相同的酶检测结果，并对图6b中小鼠1(左)的光学成像进行了验证。

图6. (a)静脉注射18f - fmiso (300 μCi, 0.9% NaCl aq.溶液，0.2 mL) 90min后的A549瘤小鼠(**，d = 12 mm)的PET/CT显像(1)冠状面，(2)矢状面，(3)横切面。(b)体内荧光成像的A549**−轴承小鼠模型(左**1到7毫米，右**的第2到 12毫米)通过**注射注入20 μM Cy7-1 0.05 mM Tris缓冲液的解决方案(100 μL) 5分钟后收集到的荧光信号在800±12 nm,730 nm辐照功率密度为1 mWcm⁻²。(c) 老鼠(b)中A549**的**区域荧光提高比率。(d) 左老鼠1 (b)的酶检测结果。 (1)：A549**样本旁边的正常组织；(2)：A549**组织样本；(3)：正常标记关系；(4)蛋白质分子量标准。

作者选择小鼠急性腹膜炎模型来研究Cy7-1与活性氧的体内相互作用。与正常小鼠相比，急性腹膜炎小鼠出现了严重的肠腔水肿和充血。在腹腔注射Cy7-1后的较长时间内，整个肠-腹腔区域均未观察到明显的荧光增强，而在**区域则有8倍的荧光增强(图7)。因此，Cy7-1是一种新的近红外探针，可以通过体内生物成像来区分缺氧**和炎症组织。以Cy7-1为探针，用人工组织对生物成像的穿透深度进行了研究。当激光激发功率密度固定在1 mW cm⁻²时，荧光强度随着人工组织厚度的增加而降低。当激发功率强度增加，人工组织厚度设置为6mm时，可以监测到信号，信噪比增加到3左右。说明Cy7-1具有良好的光穿透深度和较低的近红外激发功率密度，可作为一种优良的生物成像探针。

图7. Cy7-1 (20 μM, 200 μL)注射急性腹膜炎模型小鼠后荧光强度的变化。插图： 通过腹腔注射注入模型小鼠的Cy7-1的基于时间的体内荧光成像。在730 nm连续激光