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CO荧光探针CAS 855751-82-5的产品应用

时间:2021-06-16 09:27:19       浏览:1572


内容提要

近年来,活细胞中一氧化碳(CO)的荧光检测备受关注。由于缺乏有效的构建CO荧光探针的方法,活细胞中CO的荧光检测仍处于起步阶段。本文首次报道以烯丙基醚为反应位点构建CO荧光探针的方法。通过这种方法制备了两种易获得的烯丙基荧光素醚,它们是在PdCl2存在下对CO具有高度选择性和敏感性的探针。这些探针具有稳定性好、水溶性好、比色性好、荧光开启信号变化显著等优点可以用很低的剂量检测和跟踪活细胞中的CO有望成为生物系统中检测CO非常有前途的生物工具。

 

前言

一氧化碳(CO)可以在人体的血红素分解代谢过程中内源性产生,它被证明是一种重要的细胞信号分子,可以保护我们免受血管疾病、炎症甚至癌症的伤害,引起了对CO的前所未有的关注随着CO在生物学中的研究不断深入,开发选择性、灵敏的方法实时跟踪生命系统中的这种小气体分子具有重要的科学意义。由于荧光检测方便、灵敏度高、实时无损检测等优点而倍受青睐。CO荧光探针的构建仍处于很早期的阶段,目前报道CO荧光探针主要使用遗传编码蛋白和有机钯配合物,要么需要大量复杂的加工,要么难以合成响应时间较长(30 ~ 60分钟)因此迫切需要开发新的方法来构建具有优良传感性能的一氧化碳荧光探针。作者最近使用了廉价、高荧光荧光素和众所周知的Pd(0)介导的Tsuji-Trost反应,开发了一种易于获得的CO荧光开启探针(FL-CO-1)该方法对CO具有良好的传感性能,可方便地用于活细胞中CO的检测。由于碳酸烯丙基保护基团的稳定性不够,FL-CO-1的稳定性不是很好。为了解决这个问题,作者研究了第二代以烯丙基醚为保护基团和反应位点的CO荧光素探针(探针1和探针2)。烯丙基醚相对于碳酸烯丙基更稳定。烯丙基也很容易被Pd(0)介导的Tsuji−Trost反应去除。这些烯丙基醚具有良好的稳定性,可以方便地用于CO的体外和活细胞检测,且性能优良传感特性为设计CO荧光探针提供了一种新的方法。

 

结果与讨论

作者首先将探针1和探针2与我们的第一代基于荧光素的CO探针(FL-CO-1)进行了稳定性比较。由于荧光素结构的内酯形式,探针1和探针2PBS缓冲液中都是非荧光的。然而,探针FL-CO-1PBS缓冲液中随着时间的推移显示出相当大的荧光增强,这表明它对pH值很敏感)。此外,FL-CO-1对紫外光也很敏感。探针1和探针2在相同的条件下没有显示任何变化。探针12具有良好的稳定性和优良的光稳定性,远远优于FL-CO-1。探针12Pd2+没有响应,但对Pd(0)显示出快速和显著的荧光增强。考虑到Pd2+可以被CO原位快速还原为Pd(0),因此,12可以作为CO候选探针。CORM-3水溶性CO的缓释剂研究了探针1和探针2PdCl2存在下对CO的响应。如图1所示,添加CORM-35 μM探针+ 5 μM PdCl2PBS缓冲(10 mMpH7.4)显示快速荧光刺激反应,在20分钟内,两个探针的荧光强度的解决方案都增强了150倍。因此,在探针1和探针2的溶液中都可以观察到强烈的黄绿色荧光(1ac)因此探针1和探针2都可以作为荧光探针在温和的条件下快速检测水溶液中的CO

 

1。在37PBS缓冲液(10 mM, pH 7.4)中加入CORM-3 (100 μM)后,探针体系(5 μM探针+ 5 μM PdCl2)的荧光光谱发生变化。(a)添加CORM-3后的探针1(b)探针1516 nm处的荧光强度比F/F0随时间的变化。(c)添加CORM-3后的探针2(d)探针2527 nm处的荧光强度比(F/F0)随时间的变化。在365 nm的光下,发射光谱的颜色变化分别插入(a)(c)

 

在探针1和探针2溶液中加入不同浓度的CORM-3。动力学实验表明,加入CORM-3 (10 ~ 400 μM)后,12的反应均顺利进行,产生剂量和时间依赖性的荧光增强。在荧光光谱变化中,随着CORM-3浓度的逐渐增加,两种探针溶液的荧光均呈逐渐增加的趋势大约520 nm,直到逐渐接近饱和。探针的荧光变化和CORM-3浓度(0−50 μM)呈现出良好的线性关系(2)。探针12的检测限分别为46 nM(1.3 ppb)29 nM (0.8 ppb)

 

2(a)添加不同浓度的CORM3 (0 ~ 50 μM)后探针1 (探针1 + PdCl2,各5 μM)的荧光光谱变化。(b)探针1516 nm处的荧光强度随0 ~ 50 μM浓度的变化呈线性关系。(c)加入不同浓度的CORM-3 (0 ~ 50 μM)后,探针2 (探针2 + PdCl2,各5 μM)的荧光光谱变化。(d)探针2527 nm处的荧光强度随0 ~ 50 μM浓度的变化呈线性关系。所有数据采集于PBS缓冲液(10 mM, pH 7.4)中,37,混合20 min后获得各光谱。

 

选择性的探针12对近40种不同分析物包括常见的阴离子,如F-ClBrAcOHCO3,N3NO3,SO42−, HSO4HSO3,HS, SCNCNClO4IO4P O43−HPO42−,生物硫醇如CysHcyGSH,氨基酸如SerTrpAlaPheGlnGluLysLeuGlyIle,以及活性氧/(ROS/RNS),如ClOH2O2NO2NOHNOROO•tBuOO••OH。如图3所示,只有添加CORM-3时,探针1和探针2溶液的荧光增强效果显著,而其他分析物的荧光增强效果几乎为0。探针12系统对CO都具有高度选择性。

 

3。探针1和探针2溶液对不同分析物(100 μM)的荧光光谱和荧光强度响应。(a, b)探针1溶液(探针1 + PdCl25 μM)(c, d)探针2溶液(探针2+PdCl2,各5 μM)。各种分析物(1)SO42−,(2)HSO4(3)HSO3,(4) AcO−,(5)F, (6) Cl, (7)Br, (8)I-, (9)ClO, (10)IO4, (11)ClO4, (12) NO3-, (13)SCN, (14) CN, (15)N3, (16) HCO3, (17) ROO•, (18) NO,(19)H2O2, (20)tBuOO•, (21) HNO,(22)•OH, (23) HS, (24)Cys, (25)Hcy, (26) GSH,(27)Ser, (28) Trp, (29)Ala, (30)Phe, (31)Gln, (32) Glu (32), (33) Lys, (34) Leu, (35) Gly, (36) Ile, (37) Pd2+, (38) CORM-3。在37°C PBS缓冲液(10 mM, pH 7.4)中混合20分钟后监测所有光谱。

 

两种CO探针系统的光学变化均显示出相应的高荧光荧光素的形成。为了证实这一点,探针12的反应混合物受到质量和TLC分析。反应混合物的质量分析(探针1+PdCl2+CORM-3) 5分钟表现出明显的峰值为333.0779,说明反应确实产生了荧光素。合成单烯丙基荧光素醚并作为薄层色谱分析的参考样品,TLC分析结果清楚地表明,该反应经过了一个单烯丙基醚中间体,然后转化为荧光素作为最终产物。探针2的反应混合物的质量和薄层色谱分析也可以得到类似的结果。这些结果表明,探测系统对CO的传感机制图下图所示。

4探针12检测CO的传感机制

 

受其溶液条件下优异性能的鼓舞,研究了探针1和探针2在活细胞CO成像中的潜在应用。MTT分析表明,探针1系统对活细胞具有极低的细胞毒性甚至可以达到50 μM。探针2系统对活细胞显示了一定程度的细胞毒性,这可能是由于卤素原子的存在。由于探针1和探针2都是高度敏感的,我们可以使用探针在很低的剂量(1μM)对活细胞中的CO进行荧光成像。图5结果表明,用1 μM探针1对活HeLa细胞中的CO进行成像。可以看到,当HeLa细胞与探针1或探针1PdCl2(每个探针1 μM)孵育30分钟时,没有观察到荧光(5A1,B1)。当细胞用CORM3预孵育,然后用探针系统孵育(探针1+PdCl2,各1 μM)时,观察到剂量依赖性的细胞内荧光(5C1−E1)。当探针2的探针尺寸为1 μM时,可以观察到类似的结果。探针1和探针2都可以用于检测活细胞中的CO

 

5. 利用探针1系统(探针1 + PdCl2,每个探针1 μM)HeLa细胞中的CO进行荧光成像。A−E:亮场图像。最底层A1−E1: A−E的荧光图像,激发波长为450 ~ 480 nm(A1)细胞孵化与探针1(1 μM) 30分钟。(B, B1)细胞孵化与探针1PdCl2(1μM) 30分钟。(CC, DD1, EE1)细胞preincubated 1510μMCORM-3 30分钟,然后用探针1PdCl2(1 μM) 30分钟,分别。比例尺= 20 μm

在活细胞中,血红素可以刺激更多的血红素加氧酶(HO)衍生的CO,我们也研究了探针12检测血红素处理后内源性CO的能力。如图6所示,当细胞与血红素在探针1PdCl2的混合物(1 μM)孵育前,细胞显示时间依赖性的荧光增强(6A1−C1)。这说明血红素处理内源性CO产生的过程可以通过探针1跟踪。如果使用探针2,可以观察到类似的结果。因此,这些结果表明探针1和探针2对内源性CO有很大的成像潜力。

 

6。利用探针系统(探针1 + PdCl2)HeLa细胞中亚铁血红素刺激产生的CO进行荧光成像。上行A−C和下行A1−C1分别为亮场图像和相应的荧光图像,激发波长为450 ~ 480 nm100 μM血红素预孵育1 h (A, A1)5 h (B, B1)10 h (C, C1),然后分别用探针系统(探针1 + PdCl2,各1 μM)孵育30 min。比例尺= 20 μm

 

结论

作者首次报道了将烯丙基醚作为反应位点开发出两种新的CO荧光探针。这两种CO探针表现出比我们最近报道的基于烯丙基碳酸酯的CO荧光探针更好的稳定性,更重要的是,在PdCl2的存在下,这两种探针CO都表现出了良好的传感性能。它们还可以方便地用于活细胞中CO的成像。本研究不仅提供了两种新的有前途的CO荧光探针,而且为开发有效的用于活细胞CO检测的荧光探针提供了新的思路。

 

参考文献

Shumin Feng, Dandan Liu, Weiyong Feng, Guoqiang Feng*, Allyl Fluorescein Ethers as Promising Fluorescent Probes for Carbon Monoxide Imaging in Living Cells, Anal. Chem. 2017, 89, 3754−3760. DOI: 10.1021/acs.analchem.7b00135. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.7b00135

 

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