内容提要

第二近红外荧光成像(NIR-II FI)引导的NIR-II光热疗法(PTT)因其诊断准确，增强了对癌症的治疗效果，具有明显的优势。开发具有优异NIR-II荧光和PTT性能的共轭聚合物存在强的非辐射衰减、在有机溶液中的低溶解度和显著的聚集引起的猝灭(ACQ)效应等问题，本文通过引入烷基侧链修饰的双噻吩(2TC)作为富电子给体单元，得到了在NIR-II区具有良好溶解度和强的NIR-II FI信号的共轭聚合物TTQ-2TC。由TTQ-2TC制备的水溶性纳米颗粒(TTQ-2TC NPs)用于精确的NIR-II FI引导的NIR-II PTT治疗。体内血液和**成像及治疗表明TTQ-2TC NPs具有较高的信号-背景比(SBR)和NIR-II PTT良好的抗**疗效。

前言

近年来，，光学成像引导的光热治疗(PTT) 由于其优越的诊断精度，是一种很有前途的抗癌治疗策略。迄今为止报道的绝大多数PTT平台都是基于近红外第一光学窗口(NIR- I，750-900 nm)，其治疗效果极大地限制在小的组织穿透深度和低的最大允许激光功率，如0.33 W cm ^{- 2}的808 nm)。因此，1064 nm波长的光作为PTT的光触发器受到越来越多的关注，因为它在正常组织中穿透更深，并且NIR-II区域(1000~1700 nm波长)的最大允许激光功率(1 W cm⁻²)。共轭聚合物(CPs)因其易修饰的化学结构、可定制的近红外吸收、优越的光热转换和优良的生物相容性等诸多优点而受到人们的广泛关注。在目前的光学成像方法中，无创NIR-II荧光成像(NIR-II FI，1000~1700 nm)具有较高的组织穿透深度(约5~20 mm)，在准确诊断癌症方面具有巨大的潜力。尽管NIR-II PTT和NIR-II FI的结合为癌症的更准确诊断和增强治疗效果带来了希望，但是具有优异的NIR-II PTT和NIR-II FI的共轭聚合物由于其在有机溶液中的低溶解度、显著的聚集猝灭(ACQ)效应和强的非辐射衰减而使聚合物的荧光发射失活，因此对于满足准确诊断和精确高效的癌症治疗的需求具有很高的价值。本论文以三唑[4,5-g]-喹啉(TTQ)为电子受体单位，长烷基侧链修饰的双噻吩(2TC)为电子给体单元，设计合成了一种新型共轭聚合物(TTQ-2TC)，优化的1064 nm波长吸收，强的NIR-II FI信号。利用TTQ-2TC制备了NIR-II FI/NIR-II PTT光治疗纳米颗粒(TTQ-2TC NPs)，具有良好的水分散性、良好的生物相容性、良好的光稳定性和**聚集性。TTQ-2TC NPs实现了后肢和腹部血管的高分辨率血管成像。TTQ-2TC NPs在1064 nm激光照射下可产生热疗效果，具有显著的体外抗**疗效。在体内**治疗中证实TTQ-2TC NPs在NIR-II FI成像和NIR-II PTT纳米医学应用中具有很大的可行性。

结果与讨论

获得理想的聚合物具有吸收在1064 nm NIR-II PTT和NIR-II FI NIR-II有强烈的荧光，TTQ为吸电子单元， 2TC为给电子单元，实现高有机溶剂溶解度。该π共轭聚合物为TTQ-2TC通过Stille偶联聚合。TTQ-2TC共聚物在氯仿、四氢呋喃(THF)、甲苯等常用有机溶剂中可以完全溶解(图1b)。TTQ-2TC在600~1300 nm处显示吸收带，对应于D-A-D电荷转移态的分子内电荷转移(ICT)，在815 nm处的吸收峰较宽。吸收结果表明，该聚合物在1064 nm波长具有很强的吸收。采用808 nm激光激发， TTQ-2TC共聚物的主荧光发射峰位于1070 nm处，肩峰位于1270 nm处，量子产率(QY)测量为0.3%(在THF中以IR-1061标准)。TTQ-2TC THF溶液在不同滤波器(1064长通(LP)，1100−1200，1200−1300和1300−1400 nm)下的NIR-II FI(图1c)。在所有的NIR-II滤波器中，甚至在1300 ~ 1400 nm的NIR-II区域都可以清晰地观察到NIR-II成像信号。

图1。(a)吸收和发射光谱;(b) TTQ-2TC溶液在THF中的照片;(c) TTQ-2TC在不同滤光片(1064 LP, 1000−1100,1100−1200,1200−1300和1300−1400 nm) THF (0.03 mg mL−1)中的NIR-II荧光成像;808nm激光为激发)。

作者利用两亲性共聚物PS - PEG负载TTQ-2TC通过超声纳米沉淀法。图2a为TTQ-2TC NPs在水中的吸收光谱和发射光谱。TTQ-2TC NPs在700~1200 nm有较宽的吸收峰，吸收峰为880 nm。在808 nm激光照射下，TTQ-2TC NPs在1050 ~ 1400 nm表现出较强的NIR-II荧光，最大发射峰和肩发射峰分别出现在1270 nm和1135 nm处。TTQ-2TC NPs具有较高的量子产率(QY)，为0.03%。TTQ-2TC NPs溶液颜色为红色(图2b)， TTQ-2TC NPs的水动力直径约为140 nm, PDI为0.13(图2b)。TTQ-2TC NPs具有球形形貌，平均直径为130 nm，透射电镜(TEM)图像(图2c)。TTQ-2TC NPs在PBS(磷酸盐缓冲盐水)、FBS(含10%胎牛血清的溶液)和DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s培养基)中基本保持一致(图2d)。考虑到TTQ-2TC NPs在水中具有高1064 nm的吸收(图2a)，并且与之前报道的NIR-II光热治疗纳米剂类似，TTQ-2TC NPs在1064 nm处的消光系数为6.2 L g⁻¹cm⁻¹(图S6a)。TTQ-2TC NPs在1064 nm激光照射下具有良好的光热转换能力，在1064 nm激光照射360 s后，0.04和0.08 mg mL−1的TTQ-2TC NPs溶液分别从30°C和67°C增加，而在相同条件下的纯水中，仅增加了2°C(如图2e所示)。在1064 nm激光照射下，TTQ-2TC NPs的光热转换效率(η)为34.9%，反映了TTQ-2TC NPs在1064 nm激光照射下的优异光热性能，具有作为PTT光热剂的潜力。

图2。(a)吸收和发射光谱；(b) TTQ-2TC NPs的水动力直径。插图：TTQ-2TC NPs荧光照片；(c) TTQ-2TC NPs的TEM；(d)不同介质中TTQ-2TC NPs；(e)不同浓度TTQ-2TC NPs在1064 nm (1.0 W cm⁻²)激光照射360 s时温度升高；(f)在恒定激光曝光(1064 nm, 1.0 W cm⁻²)下TTQ-2TC NPs的光热稳定性

TTQ-2TC NPs NPs与MDA-MB-231细胞系孵育24 h后，MTT测定TTQ-2TC NPs的体外细胞毒性，在没有1064 nm激光照射的情况下，超过95%的细胞系存活，表明TTQ-2TC NPs在0.8 mg mL⁻¹内的细胞毒性可以忽略不计。TTQ-2TC NPs孵育4 h后，MDA-MB-231细胞中检测到强烈的NIR-II图像信号。为了评价TTQ-2TC NPs对MDA-MB-231细胞的光热治疗毒性，我们首先采用MTT法测定了MDA-MB-231细胞的活性。在1064 nm激光照射(5 min, 1.0 W cm⁻²)后，随着TTQ-2TC NPs浓度的增加，细胞活力明显下降(如图3a所示)。采用Calcein-AM/PI染料染色活细胞和死细胞，“TTQ-2TC NPs +激光”组可见明显的红色荧光，显示大部分细胞坏死，TTQ2TC NPs对细胞有良好的PTT作用(图3b)。所有对照组的细胞均呈现绿色荧光，说明TTQ-2TC NPs具有最佳的生物相容性，且1064 nm激光照射对细胞无损伤。

图3。 (a)不同处理组的细胞存活率:不同浓度的TTQ-2TC NPs(黑色柱)或不(红色柱)1064 nm激光照射5 min (1.0 W cm⁻²);(b) calcein-AM/PI连体细胞CLSM图像:没有任何处理MDA-MB-231细胞，只有TTQ-2TC NPs或1064 nm激光照射(1.0 W cm⁻²,5 min)处理细胞以及TTQ-2TC NPs和1064 nm照射处理细胞。比例尺: 50 μm。

在808 nm激光照射下，TTQ-2TC NPs可以在NIR-II区(900 ~ 1400 nm)发出强荧光。因此，选择健康BALB/c小鼠进行TTQ-2TC NPs的体内NIR-II FI性能。BALB/c小鼠静脉注射TTQ-2TC NPs (1.0 mg mL⁻¹,100 μL)后，获得全身NIR-II显像。在808 nm激光照射下，从周围背景组织中可以清晰地观察到小鼠的明亮脑血管，特别是腹部(图4a,)。如图4c, d所示。通过放大脑、后肢区域，量化主血管横切面的荧光强度(以红线表示)，脑、后肢血管成像的信号背景比(SBR)分别高达8和9.5。后肢和腹部血管宽度分别为0.29 mm和0.25 mm，证实了TTQ-2TC NPs具有高分辨率成像能力，是体内NIR-II成像的理想探针。

图4。健康BALB/c小鼠注射TTQ-2TC NPs, 808 nm激光激发(1064 nm LP滤光片，100 ms曝光时间)后的NIR-II荧光图像:(a)小鼠体脉管系统，(b)腹部，(c)大脑，(d)后肢。(e)脑血管和(f)后肢的SBR(信号-背景比)和横断面荧光强度剖面图(根据红色虚线)

为了进一步评价NIR-II FI在体内**中的作用，作者将TTQ-2TC NPs静脉注射到皮下移植MDA-MB-231荷瘤小鼠体内。分别在静脉注射TTQ2TC NPs前后1、4、8、12、24 h，获得**NIR-II荧光图像(图5a)。注射TTQ-2TC NPs (1.0 mg mL⁻¹,100 μL)，**血管系统检测到较强的NIR-II成像信号。在注射后4 h，**内部明亮的NIR-II成像信号开始逐渐增加，这表明TTQ2TC NPs由于增强的通透性和保留(EPR)作用而在**组织中积累。另外，在注射TTQ-2TC NPs 12 h后，**部分量化的NIR-II显像信号不断增强并上升至最高水平(图5b)。这些结果表明TTQ-2TC NPs在NIR-II FI引导的NIR-II PTT中表现出被动靶向**的能力。为了评估TTQ-2TC NP在体内的分布，注射TTQ-2TC NPs 24小时后，解剖**和主要器官(肝、肺、脾、肾、心和肠)进行体外NIR-II FI，从这些离体NIR-II荧光图像中，我们注意到清晰的NIR-II荧光信号主要见于**、肝脏和脾脏组织。说明TTQ-2TC NPs具有较强的EPR效应，可在**中积累，肝胆系统是NPs的主要代谢途径。

图5。MDA-MB-231荷瘤小鼠的体内NIR-II图像和红外热图像。(a)小鼠在静脉注射TTQ-2TC NPs后1、4、8、12、24 h的NIR-II图像(红色点圈代表MDA-MB-231**区域)(808 nm激光激发，1064 nm LP滤光片激发，曝光时间为100 ms);(b) TTQ-2TC NPs注射后不同时间**NIR-II图像的SBR;(c)经静脉注射TTQ-2TC NPs或PBS, 1064 nm光照射(1.0 W cm−2)12 h后MDA-MB-231**小鼠的红外热像;(d)**区域相应的温升轨迹与照射时间(MDA-MB-231**小鼠注射TTQ-2TC NPs或PBS)。

评价TTQ-2TC NPs在1064 nm光照射下对MDA-MB-231移植瘤小鼠体内NIR-II PTT作用。作者随机将MDA-MB-231**异种移植小鼠分成四组(n = 6):一个PBS治疗组(PBS) PBS和波长1064纳米的激光照射治疗组(PBS +激光),和一个只TTQ2TC NPs治疗组(TTQ-2TC NPs)，以及TTQ-2TC NPs与波长1064纳米的激光辐照治疗组(TTQ-2TC NPs +激光)。注射TTQ-2TC NPs 12小时后，根据NIR-II荧光成像结果，NP积累达到最大值，因此皮下**用1064 nm激光照射(1.0 W cm⁻²,10分钟)。图5c为红外热像仪拍摄的不同组小鼠经过不同治疗后**温度变化情况。**温度迅速增加到53°C TTQ-2TC NPs +激光组照射5分钟后,表明高光照转换能力TTQ-2TC NPs在**内部,虽然PBS +激光组显示只有一个微小的温度变化在相同的激光条件下32°C。在不同的治疗后，我们检测**体积和小鼠体，以定量NIR-II PTT疗效。1064 nm激光处理的PBS组和TTQ-2TC NPs组，**出现了急剧的生长趋势(图6a, b)。相反，1064 nm激光处理的TTQ-2TC NPs组，**完全被禁止生长。第14天，处死所有**小鼠，取MDA-MB-231**及其他主要组织(包括心、肺、脾、肾)进行苏木精和伊红染色分析(图6c和7)。“TTQ-2TC NPs +激光”组**细胞明显坏死，而其他三个对照组未观察到明显的组织病理学损伤。在NIR-II光热治疗下，TTQ-2TC NPs能有效地杀伤**。“TTQ-2TC NPs +激光”组小鼠的心、脾、肺、肾H&E染色(图7)显示主要组织的细胞结构无明显变化。上述结果表明TTQ-2TC制剂具有生物安全性。

图6。 (a)不同治疗后MDA-MB-231异种移植瘤小鼠**体积随时间变化曲线；(b) NIR-II PTT期末**照片；(c)不同治疗小鼠**切片的H&E染色图像。

结论

通过引入长烷基链修饰的电子给体2TC制备了一种新型共轭聚合物TTQ-2TC，该聚合物在有机溶剂中具有良好的溶解度，在NIR-II区具有优化的吸收，并具有明亮的NIR-II荧光信号。通过与两亲性共聚物PS - PEG的简单纳米沉淀法得到水溶性共轭聚合物纳米颗粒(TTQ-2TC NPs)。TTQ2TC NPs具有良好的水分散性、高分辨率的血管成像质量、良好的光稳定性以及在1064 nm波长激光照射下优越的光热效应TTQ-2TC NPs可以作为NIR-II FI引导的NIR-II PTT治疗皮下移植MDA-MB-231**的有效光疗探针。

参考文献

Xingwen Song, Xiaomei Lu, Bo Sun, Hua Zhang, Pengfei Sun, Han Miao,* Quli Fan,* and Wei Huang, Conjugated Polymer Nanoparticles with Absorption beyond 1000 nm for NIR-II Fluorescence Imaging System Guided NIR-II Photothermal Therapy, ACS Appl. Polym. Mater. 2020, 2, 4171−4179. DOI:10.1021/acsapm.0c00637.

https://dx.doi.org/10.1021/acsapm.0c00637

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