内容提要

近红外II光谱的荧光成像在组织成像方面具有很大的前景。作者通过在分子和形态水平上操纵扭曲的分子内电荷转移和聚集诱导发射效应来探索有机NIR-IIb荧光团，研制了一种在NIR-II区可发射1600 nm的有机荧光染料，量子产率为11.5%。基于有机染料对活鼠血管和深层肠道进行NIR-IIb荧光成像，成像清晰度高，信号背景比增强，本研究能对有机NIR-IIb生物成像染料的发展具有启发作用。

前言

在第二近红外区域(NIR-II, 1000 – 1700 的荧光成像，由于进一步抑制光子散射和最小化的自荧光，使深层生物结构的直接可视化和实时反馈比NIR-I (800 - 900nm)更清晰。NIR-IIb (1500-1700 nm)荧光团的自荧光几乎为零，光散射更低，可进一步提高成像的时空分辨率和穿透深度。量子点(QDs)、稀土掺杂纳米粒子(RENPs)和单壁碳纳米管(SWCNTs)等无机材料已经证明可以提高体内血管和**成像的分辨率。有机材料具有潜在的生物降解性、显著的生物相容性和易于加工的优点，为NIR-IIb成像提供了相当大的前景。延长有机染料的共轭长度是一种被广泛研究的红移发射策略。当这些大型π共轭体系以生物有用的聚集态或纳米粒子出现时，强烈的分子间π-π相互作用往往导致发射猝灭。利用分子工程电子给体(D)和受体(A)降低有机荧光团的最高已占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)的能带隙是另一种有效的红移发射方法。一些具有扭曲D-A结构的荧光团表现出激发态电子转移过程性质，即扭曲分子内电荷转移(TICT)。利用TICT的优点，同时限制其非辐射衰变，可以获得发光的有机荧光团，并将其发射扩展到NIR-IIb区域。在分子水平上，暗TICT态的形成依赖于D-A单元在分子内的灵活旋转，这种运动有利于各种非辐射途径产生微弱但长波长的发射(图1a)。另一方面，通过限制分子内运动，可以获得增强的荧光强度。聚集诱导发射(AIE)可以同时实现具有红移发射和高量子产量(QY)的荧光团具有巨大的潜力。由于分子内运动(RIM)机制的限制，AIE发光原(AIEgens)在聚集时发出强烈的光(图1b)。由于由多个分子转子装饰的扭曲结构，即使在聚集状态下，AIEgens仍然可以在分子内移动，这倾向于进入暗TICT状态。通过分子水平(TICT)和形态水平(聚集)的结构调制，可以同时获得具有长波发射和高荧光QY的有机基纳米粒子(图1c)。作者设计了三个D-A型AIEgens，并将其发射扩展到NIR-IIb区域。采用强吸电子单元苯并二噻唑(BBTD)作为电子受体，三苯胺(TPA)作为供体和分子转子来表征TICT的性质。在BBTD和TPA之间引入烷基噻吩，以保证共轭主链有较大的变形。2TT-oC26B的最大发射波长为~1030 nm，尾部延伸至1600 nm, QY高达11.5%。基于2TT-oC26B有机纳米颗粒的NIR-IIb区域的荧光成像具有高分辨率和增强的信号-背景比(SBR)，可以实时清晰地显示肠道的详细结构，为内部器官成像提供了一个强大的平台。

结果与讨论

为了构建聚集态NIR-IIb发光的共轭AIEgens，分子设计包括三个要素：强D-A结构；可旋转的单位；体积庞大的π共轭桥提供了一定的空间阻碍使分子具有扭曲构象。作者选择BBTD作为强电子受体，烷基噻吩作为给体单位和π共轭桥。具有扭曲结构的TPA作为保证TICT状态形成的分子转子，同时作为第二供体单元促进电荷转移。烷基链的位置和分子转子对于确定荧光团的聚集发射是至关重要的。由于扭曲结构阻碍了强烈的分子间相互作用，与邻位烷基链单元(邻近BBTD)相结合的TPA分子转子在纳米颗粒中显示出强烈的荧光(典型的AIE)。烷基链可以提供纳米颗粒分子的空间隔离，促进分子内运动，这有利于形成暗TICT态。为了研究烷基链的影响，将直链己基(2TToC6B)、支链2-乙基己基(2TT-oC26B)和2辛基癸基(2TT-oC610B)接枝到噻吩的邻位。分子设计的关键元素集中于采用第二碳支链的烷基链，因为它们提供了可调的空间位阻，不仅可以防止分子间相互作用，而且可以促进分子内运动。与具有线性己基的2TT-oC6B相比，具有支化2-乙基己基的2TT-oC26B的分子内运动具有更大的扭转构象，而具有更多受阻的2-辛基癸基的2TToC610B的分子内运动空间最大。如图1所示，噻吩与BBTD之间的大二面角(~50°)证实了邻位烷基链的空间效应。图    在分子水平上，这三个分子在四氢呋喃(THF)溶液中表现出典型的电荷转移(CT)吸收带，在~700 nm处，而它们的发射最大值位于NIR-II区域，为高清晰度的荧光成像提供了平台。为了考察这三个分子在较高形态(聚集态)下的荧光性质，我们记录了它们在不同水分数(fw)的THF/H_{混合物中的光致发光(PL)光谱。随着水加入到THF中，2TT-oC26B的发射强度逐渐降低，直到fw= 40%，伴随着红移发射，表明了TICT特性的显著溶剂化效应(图3a)。为了支持聚集过程中TICT特性的存在，进一步向体系中加水，水的加入量从40%增加到90%}，的荧光强度显著增强，这是由聚集体形成引发的RIM机制所致。在~1030 nm处的长波长峰表明2TT-oC26B聚集体的TICT特性仍然存在。同样，2TT-oC6B和2TT-oC610B也具有TICT+ AIE特性(图3b)。因此，主链(thiopheneBBTD-thiophene)扭曲和供体(TPA)扭曲的结合有利于TICT和AIE效应的共存，通过操纵分子内运动聚集了长波长发射(TICT)和强发射强度(AIE)的优势。为了进一步在形态水平上研究荧光性质，作者使用生物相容性两亲共聚物(DSPE-PEG2000)作为掺杂基质，通过纳米沉淀法将AIEgens制备成纳米粒子(AIE NPs)(图4a)。一方面，由于表面PEG降低了免疫识别能力，减少了蛋白质的吸附，使得AIEgens具有良好的胶体稳定性和良好的血液循环时间。另一方面，纳米粒子触发对分子内运动的调制，从而产生明亮的长波长发射。AIE NPs在NIR-II区域表现出发射，与它们的溶液态分布相似。它们的发射光谱甚至扩展到1600 nm(图3c)，能够进行NIR成像。这些AIE NPs的QY测定为11.5%，，。整个NIR-II地区(1000 - 1600 nm) 2 和2分别以IR-26为参考(图3d)；而NIR-IIb区域(1500-1600 nm)的QY分别为0.12%、0.11%和0.09%。这些AIE NPs的吸收最大值位于730 nm，对深层组织激发和避免没有光损伤 (图3 e)。最重要的是，这些AIE NPs在连续激光照射下表现出良好的光稳定性(图3f)。这些结果支持这些AIE NPs可以用于NIR-IIb荧光成像。

图3。 在THF/水混合物中具有不同水组分(fw)的PL光谱。的三个分子的PL强度(I/I0)变化，其中I和I_{的PL强度最大。纳米粒子的PL光谱。插图:放大发射光谱在1500-1600 nm。三种化合物纳米颗粒(1000-1600 nm)和IR26 (1050-1500 nm, QY=0.5%)在五种不同浓度下的荧光光谱图。纳米粒子的吸收光谱。连续辐照(110mw /cm^{下的吸收强度(A/A}图，其中A和A分别为激光辐照前和后的最大吸收强度。}

    受2TT-oC26B NIR-IIb区域红光和更高QY的启发，评估了其NIR-IIb的体外成像能力。动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)测量得到的2TT-oC26B NPs的直径在60 nm左右，具有良好的水分散性和均匀的球状结构(图4b, c)。使用三种不同的长通滤波器(1100、1200和1500 nm)记录了不同浓度(0.1、0.2、0.5 mg/mL)的2TT-oC26B NPs图像(图4e)。当用793 nm激光激发时，NPs在这三个窗口显示出明亮的荧光。虽然在1500-1600 nm区域的QY仅为0.12%，但在NIR-IIb窗口可以观察到强发射。为了进一步比较2TT-oC26B NPs在不同近红外窗口的生物成像能力，将充满2TToC26B NPs的毛细管浸泡在1%的脂质溶液中，在尖状的phantom深度。即使在6 浸没深度下，在NIR-IIb区域也能分辨出清晰的管边界，但在NIR-I区域管边界模糊不可见。尽管由于QY最高，最亮的图像记录在NIR-II区域，基于几乎为零的自荧光和更低的光子散射的优势，其SBR(1.8)和半峰宽的分辨率显著低于NIR-IIb (SBR= 3.1和FWHM= 0.32 cm)。这些数据表明，2TT-oC26B NPs适用于NIR-IIb荧光成像。

图为初始直径。    荧光血管造影是一种将荧光探针注入血液的医学策略，对循环系统和疾病诊断具有重要意义。为了进一步研究NIR成像的优势，作者将2TT-oC26B NPs静脉注射到小鼠血流中，使用不同LP滤光片(1100、1200和1500 nm)的InGaAs相机记录其血管造影。静脉注射2TT-oC26B NPs 10 min后，小鼠的整个血管网络清晰可见(图5)。与传统的NIR-II成像(1100和1200 nm LP滤波器)相比，NIR-IIb成像在近似透明的背景下显示出更高的分辨率(图5a-c)。类似毛细血管的横断面强度(红色圆圈)被绘制出来比较SBR。1500 nm LP的NIR-IIb窗的SBR为2.0，高于1200 nm LP的1.2和1100 nm LP的1.1，显示了NIR-IIb成像的优势。通过对所选区域的半宽测量，1100、1200和1500 nm LP的相似血管图像的表观宽度分别为0.58、0.56和0.41 mm(图5d-f)，表明NIR-IIb成像具有最高的空间分辨率。特别是靠近肝脏的血管，1100和1200 nm LP不能清晰地看到，而1500 nm LP可以清晰地看到。高分辨率和低本底干扰为早期疾病提供更准确的诊断信息。

图。   在Balb/c裸鼠体内静脉注射2TT-oC26B NPs，进一步勾画完整头皮和颅骨的脑血管系统。清晰观察到脑血管，分辨率~71.6μm(图6a-c)。为了准确检测精细的血管结构，作者还对大脑进行了高倍透颅显微血管成像。如图6d-f所示，可以明显地看到小血管的表观宽度只有10μm。这种高分辨率是由有机分子在NIR-IIb区域的低倍和高倍成像中实现的。2TT-oC26B NPs由于自身荧光显著减少和光子散射最小化，表现出了高分辨率和高SBR的高性能NIR-IIb血管造影，在体内成像方面显示出巨大的优势。荧光成像的局限性之一是穿透深度，因此难以透视身体来监测胃肠道(GI)等内部软组织，胃肠道疾病与糖尿病、甲状腺疾病、结直肠癌等多种疾病相关。虽然磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)已被广泛用于临床诊断肠道疾病6，但有限的空间分辨率、较长的成像时间和有害的辐射风险限制了对肠道功能的监测。NIR-IIb成像由于其优越的时空分辨率，为实时监测肠道功能提供了平台。因此，在口服2TT-oC26B NPs  后的不同时间点，使用不同的LP滤片(1100、1200和1500 nm)对肠道结构进行成像。如图7a所示，分别在0.5、3、5、6 h灌胃后可看到回肠、盲肠、结肠和直肠。在1100 nm和1200 nm LP下均能检测到组织，但图像模糊，分辨率低。相比之下，在NIR-IIb区域，使用1500 nm的LP滤波器可以在背景可忽略的情况下区分清晰的组织特征分辨率。即使是肠道深处坐落在~ 5毫米深度,个人小肠憩室(~ 1毫米)也明显歧视(图7)。长波长成像的空间分辨率增强肠道的精细结构,显著提高SBR(图7 b, c)。同时，盲肠结构也可以在1500 nm LP减少曝光时间下清晰勾画出来。在成像过程中可以清楚地监测肠的收缩功能。即使我们以大鼠为模型，其肠结构在约8 mm深度的NIR-IIb区域可以观察到高清晰度的肠结构，而在NIR-I和NIR-II区域则很难区分。利用有机NIR-IIb探针可以在如此高的分辨率下监测小鼠和大鼠的微妙肠道结构。最后，在灌胃24 h后，2TT-oC26B NPs全部以粪便形式从体内排出，而不经肠道进入体内，有利于口服GI诊断造影剂的研制。因此，2TT-oC26B NPs可能是评估深层组织疾病的一个强大平台。

图沿

结论

作者展示了使用TICT和AIE联合策略的纯有机纳米颗粒用于高质量的NIR-IIb荧光成像。分子设计的关键因素是骨干扭曲与扭曲分子转子的结合，以调节聚集的分子运动和防止有害的分子间相互作用。在分子水平上，扭曲的NIR-IIb发射体更有利于分子内运动，从而形成TICT态。在形态水平上，分子聚集部分地限制了分子内运动，从而提高了荧光效率。由于具有多个转子的扭曲三维结构，即使在聚集状态下，AIEgens仍然保持分子内移动。因此，通过分子水平(TICT)和形态水平(聚集)的结构调节，有机NIR-II 纳米颗粒同时具有红移发射和高荧光QY。合成的2TT-oC26B NPs的发射光谱延伸至1600 nm，整个NIR-II (1000-1600 nm) QY为11.5%，NIR-IIb (1500-1600 nm) QY为0.12%，为NIR-IIb血管和肠道的高质量荧光成像提供了平台，对进一步开发具有超长发射波长和高亮度的有机分子具有启发作用。

参考文献

Design of AIEgens for near-infrared IIb imaging through structural modulation at molecular and morphological levels,Yuanyuan Li, Zhaochong Cai, Shunjie Liu, Haoke Zhang, Sherman T.H. Wong, Jacky W.Y. Lam, Ryan T.K. Kwok, Jun Qian*,Ben Zhong Tang*, Nat. Commun., 2020, 11, 1255. DOI: 10.1038/s41467-020-15095-1.https://www.nature.com/articles/s41467-020-15095-1

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