内容提要

树突状细胞(DC)疫苗是一种有效的癌症免疫治疗策略，通过将抗原携带到树突状细胞中，并在接种后将树突状细胞移出引流淋巴结。本文报道了一种用于摄取抗原和激活树突状细胞的第二近红外窗口(NIR-II)荧光纳米颗粒。将卵清蛋白(OVA，一种免疫抗原) 通过静电相互作用负载在聚赖氨酸(PLL) 修饰的NIR-II荧光纳米颗粒的表面，表现出生物相容性和强的选择性相互作用。这些载抗原复合物可被未成熟树突状细胞有效吞噬，诱导树突状细胞成熟并分泌细胞因子。皮下注射后，纳米粒子高度敏感的NIR-II荧光信号表明，纳米粒子标记的树突状细胞可以成功地在体内迁移到淋巴结，在癌症免疫治疗方面显示了的巨大前景。

前言

**疫苗、过继T细胞治疗和免疫检查点封锁是近年来**免疫治疗领域的三种主要方法，受到了广泛关注。癌症疫苗可以启动免疫应答，诱导对癌细胞特异性抗原表达的保护性免疫。树突状细胞(DC)是最强的抗原呈递细胞，在激发T细胞中起着关键作用。近年来，许多DC疫苗被开发用于癌症免疫治疗，活化的DC作为DC疫苗用于免疫治疗来解决这些问题。在基于DC的免疫治疗中，DC的有效性是关键，因此实时的DC跟踪就显得尤为重要。实时的体内DC成像可以为临床治疗中分析活化的DC如何迁移和改进治疗方法提供有价值的数据。目前已经发明各种非侵入性追踪系统来追踪DC，包括荧光成像，磁共振成像(MRI)，正电子发射断层扫描(PET)和闪烁成像。尽管DC跟踪技术取得了很大的进展，但由于现有成像系统的局限性，在高灵敏度的体内精确计算DC的迁移仍然是一个挑战。近年来，第二近红外窗口(NIR-II)荧光成像(1000 - 1700 nm) 以较长的波长探测光子，可以减少光子在自身荧光较低的生物组织中的散射，实现更高的空间分辨率和更深的组织穿透，得到了广泛的研究。有机分子材料因其良好的生物相容性和快速排泄能力而受到研究者的青睐。本研究作者开发了一种新的DC疫苗，具有体内NIR-II荧光跟踪能力的抗原传递系统，合成了一种四臂聚合物TTQ- PLL，具有电子给体-受体(D-A)荧光核，产生NIR-II荧光信号。该聚合物负载鸡蛋卵清蛋白(OV A)，可以有效结合OV A形成TTQ-PLL@OV A复合物。该复合物易于被树突状细胞摄取，并通过增强免疫因子分泌刺激标记树突状细胞达到更高的成熟水平。这种树突状细胞从脚掌到引流淋巴结的归巢机制可以通过NIR-II荧光成像进行监测，为基于NIR-II探针的免疫治疗领域带来了广泛的兴趣。

结果与讨论

考虑到内涵体和溶酶体中存在蛋白酶，研究了TTQ-PLL在不同pH下的光学性质。TTQ-PLL显示最大吸收约740 nm，NIR-II荧光发射在1050 nm。在808 nm激发下，TTQ-PLL pH值7.4的荧光强度略低于在pH值为5.0(图1)，因此，TTQ-PLL具有在生理条件下具有良好的光学特性。在808 nm激光照射1 h后，荧光强度没有明显变化，具有良好的光稳定性。根据pH 7.4和5.0下动态光散射的结果，TTQ-PLL的水动力粒径分别约为44.2和41.7 nm(图1c)。TEM图像显示TTQ-PLL的半径约为40 nm (图1d)。以IR1061为参考，测得TTQ-PLL的荧光QY为1.24%。TTQ-PLL可以作为NIR-II荧光探针进行进一步研究。如图2e, f)所示， 0、1、4、6和8 mm鸡乳肉组织下TTQ-PLL的NIR-II荧光图像和强度结果表明，TTQ-PLL的NIR-II荧光信号的组织穿透率可达~6 mm。因此，这些数据表明TTQ-PLL可以作为一种NIRII荧光探针。

图1。 (a) TTQ-PLL在pH 7.4和5.0下的紫外-可见吸收光谱，(b)荧光光谱和(c)水合动力学尺寸。(d) TTQ-PLL TEM图像。(f) TTQ-PLL在0、1、2、4、6、8 nm处的NIR-II荧光强度。

将不同比例的OVA与TTQ-PLL混合10 min，在PBS中制备TTQ-PLL@OV A纳米粒子，并利用FITC对OV A进行预标记以跟踪这一过程。由于阳离子侧链密度高，TTQ-PLL的负载率达到18.69%。通过TEM和DLS分析研究了配合物的形貌和尺寸，如图2a, b所示。在pH 7.4和5.0条件下，TTQ-PLL@OV A复合物的水合动力粒径分别为49和46 nm，TEM粒径为45 nm。由于与OV A结合，TTQ-PLL@OV A的粒径比结合前大。如图2c所示，由于赖氨酸侧链上的氨基，TTQ-PLL带正电荷。将OV A与这些纳米粒子混合后，Zeta电位显著降低。图2d显示了不同pH值下OVA的释放曲线。pH值为5.0时，8 h后OVA的释放量为80%，而pH值为7.4时，8 h后OVA的释放量仅为27.1%，这可能与PLL在酸性条件下的质子化有关。由于内涵体和溶酶体的酸性环境以及较低pH下OVA的快速释放，TTQ-PLL可能在进入树突状细胞后释放OVA，并被这些细胞作为抗原呈现。

图2 (a) TTQ-PLL在pH 7.4和5.0下的水合动力学尺寸。(b) TTQ-PLL@OVA的TEM图像(c) TTQ-PLL@OV A不同质量比时的Zeta势。(d) OVA在不同pH值下TTQ-PLL的释放。

为了研究TTQPLL@OV A的潜在应用，采用MTT法对其细胞毒性进行评价。因为生物可降解和生物相容的聚TTQ-PLL和TTQ-PLL@OVA对树突细胞几乎没有细胞毒性，表明其具有良好的生物相容性，具有作为树突细胞疫苗的潜力。为了研究细胞摄取，FITC标记OVA制备TTQ-PLL@OVA复合物，采用流式细胞术分析DC对FITC-OVA的摄取。DCs是分别处理OVA和TTQPLL@OVA复合物为0, 0.5, 1, 1.5, 2 h。TTQ-PLL@OV经处理的细胞显示荧光强度明显高于OVA 2 h后经处理的细胞治疗,这表明TTQPLL@OV优于OVA抗原递送(如图3 a和3b)。作者进一步采用NIR-II荧光成像技术研究了体外细胞摄取情况。用TTQPLL@OVA (QY=1.18%)孵育2 h后，捕获DC的NIR-II荧光图像。由于TTQ-PLL@OVA的摄取，TTQ-PLL@OVA孵育的DCs的NIR-II荧光信号显著高于对照组 (图3c, d)。因此，TTQ-PLL@OVA孵育的DCs适用于体内示踪。

图3。FITC-OVA， (b) TTQ-PLL@FITC-OV A孵育的DC中FITC标记OVA的变化。(c) NIR-II荧光图像和(d) TTQPLL@OV A孵育后DC的强度。

DC成熟程度是DC免疫治疗中反映免疫反应的重要指标，可通过检测细胞膜上CD80+和CD86+的表达水平来确定。流式细胞术检测不同实验条件下树突状细胞CD80+和CD86+的表达水平，探讨树突状细胞成熟水平。在图4a中，培养后CD80+和CD86+的百分比均显著增加TTQ-PLL@OVA。同时，OVA和TTQ-PLL处理的细胞中，成熟树突状细胞的比例从5.0%显著增加到24.7%，而游离OVA和TTQ-PLL处理的细胞中，成熟树突状细胞的比例分别仅达到5.1%和8.2%。TTQ-PLL@OVA处理后，DC成熟水平显著提高了约5倍。这些结果表明，DC成熟水平的提高可归因于TTQ-PLL@OVA易于被DC吸收，最终导致更强的免疫应答。治疗后释放的细胞因子，如TNF-α和IL-1β，触发了树突状细胞的成熟、活化和免疫刺激活性。本研究采用ELISA试剂盒检测树突状细胞分泌TNF-α和IL-1β。如图4b和4c，TTQ-PLL@OVA孵育的树突状细胞中TNF-α和IL-1β的分泌量远远高于无TTQ-PLL或OV A孵育的树突状细胞，TTQ-PLL可以释放OV A诱导树突状细胞成熟并释放细胞因子。因此，这些由TTQPLL@OV A激活的具有细胞因子分泌能力的成熟树突状细胞可以作为DC疫苗。

图4。TTQ-PLL@OV A体外免疫调节活性。(a)流式细胞术检测CD80+和CD86+表达。(b) TNF-α和(c) IL-1β的分泌通过ELISA法测定。

在基于树突状细胞的免疫治疗中，活化树突状细胞迁移到引流淋巴结是基于DC的免疫治疗的关键。高灵敏度的体内DC跟踪是非常理想的，可以为临床治疗中改进治疗方法提供有价值的信息。作者将TTQ-PLL@OVA和TTQ-PLL标记的树突细胞分别注射到C57BL/6小鼠的左足垫，模拟迁移的进程。给药后用NIR-II荧光成像系统检测DCs的NIR-II荧光信号。在TTQPLL@OVA标记的树突状细胞注射后24 h，淋巴结内可见NIR-II荧光信号，48 h时该信号进一步增强，说明TTQPLL@OVA标记的树突状细胞从注射部位逐渐迁移到引流淋巴结(图5a)。对DC注射侧和TTQ-PLL@OVA标记的dc注射侧淋巴结进行体外成像(图7b, c)，证实了TTQ-PLL@OV A标记的树突细胞可以有效地呈现抗原，并促进树突细胞向局部淋巴结迁移。注射后14天后进行了(H&E)染色主要器官(心、肝、脾、肺和肾)的组织学检查显示TTQ-PLL@OV A标记dc具有良好的生物安全性。

图5。(a) 通过足垫注射模型评估树突状细胞对局部淋巴结的靶向能力(红色箭头表示注射部位，红线包围的圆圈区域表示局部淋巴结)。(b)局部淋巴结归巢成像和(c)标记树突状细胞处理后的平均荧光强度。

结论

作者合成了一种NIR-II荧光探针，该探针具有良好的水溶性、良好的光稳定性和较强的载抗原能力，可用于OVA递送系统。在负载该抗原后，TTQ-PLL@OVA可以有效地诱导树突状细胞成熟和细胞因子的释放，还可以标记树突状细胞可作为树突状细胞疫苗，利用其固有的NIR-II荧光信号跟踪DC在体内向淋巴结迁移的过程，对于了解刺激树突状细胞在基于树突状细胞的免疫治疗中迁移和功能的细节具有重要的临床意义。

参考文献

Chao Wang, Bo Sun, Hui Bao, Tao Wang, Wenjuan Xu, Pengfei Sun*, Quli Fan*, Wei Huang, NIR-II probe modified by poly(L-lysine) with efficient ovalbumin

delivery for dendritic cell tracking, Sci. China Chem, 2020, 63, 1272-1280.

DOI：10.1007/s11426-020-9780-8.

https://link.springer.com/article/10.1007/s11426-020-9780-8

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