内容提要

研究供体-受体-供体(D-A-D)结构对荧光性质的影响机制对小分子NIR-II荧光团的设计具有重要意义。基于这种D-A-D结构，通过调节最高被占据分子轨道和最低未被占据分子轨道能级筛选吸电子或给电子基团和π桥基团，获得NIR-II的荧光发射。以噻吩(T)、三苯胺(TPA)、9,9-二辛基芴(F)为电子供体，制备了系列以噻吩异靛蓝(TIIG)、6,7-双(4-己氧基苯基)-4,9-二(噻吩-2-基)-[1,2,5]噻二偶氮唑[3,4-g]喹恶啉(TTQ)为受体的D-p-D型NIR-II荧光团，其中TTQ-F的荧光强度最强，量子产率最高。为了实现NIR-II生物成像的应用，用PEG5k对具有理想NIR-II发射的TTQ-F进行了修饰，获得了聚乙二醇化的NIR-II聚合物TTQ-F-PEG，实现了对小鼠血管、淋巴结、血管出血和胃肠道的体内NIR-II显像。

前言

自从首次应用NIR-II(波长在1000 ~ 1700 nm)荧光成像以来，由于具有显著的低光子散射、最小的自荧光、高空间分辨率以及低信号衰减，在生理过程的可是化方面显示出了巨大的潜力。目前已经开发了各种具有足够亮度的NIR-II荧光团用于分子成像，包括小型有机荧光团、量子点、单管碳纳米管和稀土掺杂纳米材料。由于有机NIR-II型荧光团具有生物相容性好、化学结构可设计、具有潜在的功能性等特点，是目前比较理想的荧光团。在有机NIR-II荧光团中，具有供体-受体-供体(D-A-D)结构的探针是在NIR-II窗口发射的典型小分子有机荧光团。6,7-双(4-(己氧基)苯基)-4,9-二(噻吩-2-基)-[1,2,5]噻二偶氮并[3,4-g]喹恶啉(TTQ)和硫代异靛蓝(TIIG)衍生物是典型的具有强吸电能力的共轭受体，它们具有可修饰的化学基团，可与不同的给电子体反应形成D-p-D型共轭分子。本研究以两个强电子受体TTQ和TIIG为基础，合成了8个NIR-II小分子。通过理论和实验测试研究和分析了由不同电子给体和受体组成的上述小分子的吸收和发射特性。以TTQ为受体合成的四种小分子(TTQ-Xs)的吸收光谱与以TIIG为受体合成的四种小分子(TIIG-Xs)的吸收光谱相似，但荧光光谱存在显著差异。TTQ-Xs的荧光强度明显强于TIIG-Xs, TIIG-Xs几乎没有荧光。TTQ-F在TTQ-X分子中表现突出，荧光量子产率(QY)最高，光稳定性好。体内NIR-II荧光实验表明，TTQ-F-PEG具有良好的NIR-II荧光性能。同时，LFP成像也显示了TTQ-F-PEG具有高分辨率和高稳定性的良好成像性能。

结果与讨论

如图1所示，潜在的NIR-II小分子染料采用了具有TIIG或TTQ的高效D-A-D结构作为替代BBTD应用最广泛的部分，其合成复杂，产率低。为了考察D部分的作用，选择噻吩(T)、三苯胺(TPA)、9,9-二辛基-芴(F)和2-(9,9-二辛基-芴)噻吩(TF)作为D部分与A偶联，得到8种小分子染料。上述小分子染料有两个系列，分别定义为TIIG-Xs：TIIG-T、TIIG-TPA、TIIG-F、TIIG-TF和TTQ-Xs: TTQ-T、TTQ-TPA、TTQ-F、TTQ-TF(图1)。利用密度泛函理论计算了这些小分子染料的最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)表面预测这些小分子染料的光物理性质。图1显示了所有这些小分子染料的HOMO和LUMO波函数。所有HOMO都是沿着共轭主链离域的，而TTQ- Xs的LUMO主要定位在TTQ受体上，TIIG-Xs的LUMO分布更多地定位在D-A-D核上，表明TTQ-Xs降低了分子间相互作用的概率，有利于保持激发态能量。TTQ-Xs比TIIG-Xs具有更高的HOMO能级和更低的LUMO能级，从而保证了TTQ-Xs具有更低的带隙。

图1。D-p-D型小分子染料的合成与化学结构 /几何优化后的小分子染料的HOMO和LUMO能级。

TTQ-TF的带隙最小(1.79 eV和1.20 eV)，具有较低的带隙，是NIR-II小分子染料的理想受体。如图2a所示，TIIG-Xs有两个吸收峰，TTQ-Xs有一个宽的吸收峰。这两种不同的受体基染料的主要峰位置都在600-700 nm。在相同的给体的情况下，吸收峰的红移。TTQ-Xs TIIG-Xs最大吸收峰如下：TIIG-T (633 nm), TTQ-T(644 nm), TIIG-F (637 nm), TTQ-F(655 nm), TIIG-TPA (653 nm), TTQ-TPA (687 nm),和TIIG-TF (672 nm) TTQ-TF(695 nm)。这一结果主要是由于上述TTQ-Xs具有更多的离域LUMOs和更低的带隙。730 nm激发TIIG-Xs和808 nm激发TTQ-Xs的NIR-II荧光发射光谱。如图2b所示，TIIG-XS在THF中测量的NIR-II发射信号较TTQ-Xs弱。特别是TIIG -TPA和TIIG-TF的最大荧光发射峰无法在NIR-II区域检测到。这些结果表明TIIG-Xs不适合进一步的NIR-II成像应用。TTQ-Xs在THF中的发射光谱在1000 ~ 1100 nm处有发射峰，并在1300 nm处有发射峰，允许在NIR-II区域有高分辨率的荧光成像，其中TTQ-F的荧光强度最高，发射峰在983 nm, TTQ-TPA的荧光强度最低，发射峰在1036 nm。TTQ-F显示发射QY最高的6.97%，大大高于TTQ-T(3.97%)、TTQ-TPA(3.0%)和TTQ-TF(3.37%)。此外，还比较了TTQ-Xs在THF中溶解后的1064 nm长通(LP)滤光片下的荧光和NIR-II荧光。显然，TTQ-F在这些小分子染料中荧光信号最高，而TIIG-Xs化合物没有信号(图2c)。TTQ是构建具有较强NIR-II发射的D-p-D型小分子的最优受体，可用于进一步的NIR-II成像。

图2。(a) THF中测量的小分子染料的吸收光谱和(b) NIR-II荧光发射光谱。(c)亮场图像(左)和NIR-II荧光图像(右，808 nm激光;1064 nm LP滤光片)的小分子染料。

为了实现水溶性NIR-II纳米颗粒 TTQ-X@NPs，为进一步的成像应用，将NIR-II荧光性能的TTQ-X染料被封装在一种商用两亲性三嵌段共聚物(Pluronic F127)中。这些TTQ基NPs在水相中的吸收和荧光光谱与在有机相中的相似。如图3a所示，分别在TTQ-T@NPs、TTQ-TPA@NPs、TTQ-F@NPs、TTQ-TF@NPs的737、764、733、781 nm处有主要的吸收峰。在808 nm激光激发下，TTQ-X@NPs的NIR-II荧光发射光谱显示出明显的发射带NIR-II地区。TTQ-T@ NPs、TTQ-TPA@NPs、TTQ-F@NPs和TTQ-TF@NPs的最大发射峰位于1059、1065、1060和1071 nm大(图3b)，其中，TTQ-F@NPs的荧光强度最高，分别是TTQ-T@NPs、TTQ-TPA@NPs和TTQ-TF@NPs的1.9、3.3和3.5倍(图3b)。进一步比较了1064 nm LP滤波器捕获的这些水溶性NPs的NIR-II信号，结果与预期一致，TTQ-F@NPs显示了最亮的NIR-II信号，这与荧光发射光谱的结果一致。

图3。(a)水相测量的四种TTQ基NPs (TTQ-X@NPs)的吸收光谱和NIR-II荧光发射光谱。(c)用1064 nm滤光片过滤TTQ-X@NPs溶液管中的亮场图像和NIR-II荧光图像。所有这些数据都是在相同的质量浓度为0.1 mg mL⁻¹时测量的。

为了获得更大的生物成像应用，我们选择了具有良好NIR-II发射的TTQ-F，并进一步改进其水溶性。TTQ-F与氨基PEG快速反应，得到了水溶性NIR-II 荧光聚合物TTQ-F- PEG(图4a)。TTQ-F-PEG在5 mg mL⁻¹的高浓度水溶液中具有良好的溶解性。采用动态光散射和透射电镜(TEM)对水溶液中TTQ-F-PEG的粒径和形貌进行表征(图4b)。TTQ-F-PEG具有均匀分散的球结构，平均直径为140 nm。作者研究了TTQ-F-PEG在固体或两种介质(THF和水)中的紫外-可见-近红外吸收光谱和荧光光谱。如图4c所示，TTQ-F-PEG在THF、固体和水中分别在741、798和792 nm处有主要的吸收峰。与NPs类似，TTQ-F-PEG在固体和水中表现出更大的红移吸收波长，而在THF中。TTQ-F-PEG在上述介质中同时用808 nm激光激发，记录了其NIRII荧光发射光谱。如图4d所示，TTQ-F-PEG在THF、固体和水中的主发射峰分别在1000、1093和1073 nm处检测到。这些结果表明TTQ-F-PEG具有良好的体内外生物成像潜力。

图4。(a) TTQ-F-PEG的化学结构和(b)粒径分布。图中为TTQ-F-PEG的透射电镜图像。(c)分别测定了TTQ-F-PEG在THF、固体和水中的吸收光谱和(d) NIR-II荧光发射光谱。

如图5b所示，TTQ-F-PEG在THF中比在水中表现出更亮的NIR-II信号。TTQ-F-PEG功率显示出与THF溶液相当的荧光。此外，获得了在鸡肉组织管中测量的NIR-II荧光图像(图5c)和软件分析的不同深度(0、2、4、6和8 mm)的定量荧光强度，以表征穿透深度。TTQ-F-PEG在NIR-II窗口的穿透深度可达约8 mm。TTQ-F-PEG在7天内在水中表现出良好的尺寸稳定性。因此，TTQ-F-PEG是一种很有前途的NIR-II荧光团。在小鼠后肢和腹部血管1064 nm LP过滤器内，静脉注射剂量为15 mg kg⁻¹的TTQ-F-PEG后，捕获808 nm激发下的NIR-II荧光图像。如图5d−f所示，大脑、腹部和后肢的血管系统可以清晰地从周围的背景组织中识别出来。此外，如图5g−i所示，脑、腹、后肢血管半最大值全宽分别为0.48、0.68、0.48 mm。此外，体外细胞毒性实验证实了TTQ-F-PEG的巨大安全性，即使剂量达到256 ug /mL，它对小鼠NIH3T3细胞的细胞毒性也可以忽略不计。因此，TTQ-F-PEG由于其较低的光子散射和较高的空间分辨率以及NIR-II光的信号衰减较低，因此具有良好的光学空间分辨率和对比度，从而具有较高的体内图像质量。

图5。(a) TTQ-F-PEG分别在四氢呋喃、固体和水的室内光和近红外(NIR)光照射下的照片和荧光图像。(c) TTQ-F-PEG在不同深度(0、2、4、6和8 mm)的NIR-II图像。在TTQ-F-PEG (2 mg mL−1和150 μL)处理的小鼠的大脑(d)、腹部(e)和后肢(f)血管系统的NIR-II荧光图像显示了红色实线和血管宽度分析的横断面荧光强度剖面图(g、h和i)。

由于TTQ-F-PEG具有理想的体内NIR-II荧光性能，我们还利用这种四臂聚合物开展了NIR-II成像的其它应用。如图6a、b所示，我们通过前足垫注射TTQ-FPEG，仰卧位和右侧侧卧位进行淋巴结显像，可清晰显示胸、臂淋巴结。此外，我们还成像了小鼠后肢的血管出血，这是多种疾病的并发症。如图6c、d所示，在仰卧位和俯卧位分别观察到感兴趣区域血管出血的NIR-II图像清晰清晰。而未出血的另一侧肢体未见出血的NIR-II信号。最后，利用NIR-II成像的深穿透深度优势，成功实现了胃肠道成像。即使在注射后4h，在5mm深的位置，我们也能清楚地分辨出图6e中的胃、大肠和回肠。解剖后，我们对健康小鼠的肠道器官也进行了成像。如图6f所示，在胃、小肠、结肠和直肠中分别可以观察到较强的NIR-II信号。这些成像应用表明，我们合成的四臂TTQ-F-PEG具有优异的NIR-II荧光性能。

图6。前足垫注射TTQ-F-PEG允许NIR-II显像(a)仰卧位胸廓淋巴结和(b)右侧侧位臂弯淋巴结。小鼠后肢血管出血的NIR-II FI分别为(c)仰卧位和(d)俯卧位。血管出血区域以红色虚线为界。(e)健康小鼠通过口服TTQ-F-PEG的NIR-II胃肠道成像和(f)解剖后肠道器官的NIR-II 荧光成像。

由于TTQ-FPEG具有良好的NIR-II 荧光性能、良好的光学稳定性和低毒性，该小分子在LFP的开发中具有较高的分辨率、灵敏度和选择性。TTQ-F-PEG可与淀粉混合形成TTQ-F-PEG/淀粉荧光粉，实现良好的流动性，实现指纹显影。如图7a、b所示，TTQ-F-PEG/淀粉的主要吸收峰和荧光峰出现在804和1103 nm左右，这与图4c、d中TTQ-F-PEG固体的上述结果相似。TTQ-F-PEG/淀粉的NIR-II FI信号被1064 nm LP滤波器捕获(图7c)，这表明TTQ-F-PEG/starch具有开发LFP的巨大潜力。为了测试TTQ-F-PEG/淀粉型荧光粉的LFP检测功能，我们选择了塑料、锡箔纸和玻璃三种典型底物来评估其可行性。如图7d所示，由于TTQ-F-PEG/淀粉引起的荧光信号在NIR-II窗口的高对比度，所有底物上都成功检测到LFP。即使在储存4周后，LFP的NIR-II荧光图像仍然明亮清晰，说明TTQ-F-PEG/淀粉具有很高的稳定性(图7e)。

图7。(a) TTQ-F-PEG/淀粉的吸收和荧光发射光谱。(c) TTQ-F-PEG/淀粉分别在室内光和近红外光下的照片和荧光图像。(d)分别在NIR-II光照射下，在塑料基材、锡箔纸和玻璃上的TTQ-F/淀粉染色LFP的荧光照片。(e)上述TTQ-F/淀粉染色LFP样品储存4周后的荧光照片。

结论

作者合成了8个以TTQ和TIIG为受体，T、TPA、F、TF为供体的D-p-D型有机小分子。理论计算和实验均证实TTQ作为较大的受体获得了较长的NIR-II发射波长。此外,它是发现TTQ-F最亮NIR-II 荧光信号和优良的耐光性,因为红移吸收/发射乐队和显著增强QY 6.97%的电子基效应造成的。TTQ-F经氨基聚乙二醇修饰后，在近红外窗口获得了一种吸收/发射波长为792/1073 nm的水溶性聚合物，可进一步准确成像小鼠血管、淋巴结、血管出血和胃肠道，分辨率高。TTQ-F-PEG/淀粉荧光粉可以改善LFP的开发和鉴定。不同底物上的荧光可以达到快速、灵敏的荧光效果。更重要的是，TTQ-F-PEG/淀粉的制备和LFPs的开发都比发烟法等传统方法更简单、更安全、更快。各种电子供体和基于TTQ受体的小分子NIR-II染料的设计带来了新的意义，具有强大荧光信号的TTQ- F在进一步生物成像应用方面具有巨大的潜力。

产品提供

近红外二区荧光染料