内容提要

NIR-II荧光成像大大降低了几乎所有组织类型在长波长下的散射系数，有利于深层组织成像。但是，大多数NIR-II荧光团都存在量子产率低和/或循环时间短的问题，这限制了NIR-II成像的质量。本文通过超分子组装设计了一种具有强NIR-II荧光发射的蛋白质/花菁复合物，在延长循环时间的情况下， NIR-II量子产率达到21.2%。计算模型揭示了荧光增强的机理，确定了控制近红外-II荧光团白蛋白复合物的关键参数，提供了高分辨率的微血管成像，成像窗口长达3小时。此外，络合策略被应用于抗体衍生的组件，提供高对比度的**成像，而不影响抗体的靶向能力。本研究为制备高性能的近红外Ⅱ类荧光团提供了一种简便的策略，即通过功能蛋白对菁染料进行配伍，从而获得高性能的NIR-II荧光团。

前言

近红外(NIR)荧光成像因其在术中成像的适用性而在医学界获得了广泛的应用。这种非侵入性成像方式，鉴于它的范围是700到1000 nm也被称为NIR-I成像。因为荧光团可以被组织穿透的近红外光重复激发，因此具有很高的灵敏度。与目前分子成像的临床标准-放射性核素核成像技术相比，它具有更好的优势。此外，低毒成像探针允许随时间延长成像和/或重复扫描。此外，荧光发射的对比度使周围组织的目标组织清晰可见。这项技术有可能与其他成像方式(如光声成像、超声成像、磁共振成像和正电子发射断层成像)相结合，以实现多模式成像平台。近红外成像应用包括血管造影、**和转移灶以及淋巴管成像。到目前为止，仅仅吲哚青绿(ICG)和亚甲基蓝，被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于人体研究。ICG在临床上用于心血管功能检测和视网膜血管造影，但仍然存在光子衰减大、组织自发荧光和光散射等缺点。从1000到1700 nm的NIR-II成像为这些限制提供了一个有前途的解决方案。与NIR-I成像相比，这种成像方式提供了更大的穿透力和对比度。由无机纳米颗粒和碳纳米管衍生的近红外II荧光团显示出生物相容性和安全性问题；其他典型的NIR-II荧光团如供体-受体-供体(D-A-D)染料，量子产率很低。虽然延长多亚胺结构的共轭结构产生了有效的NIR-II荧光团，但很少有水溶性或生物相容性的荧光团。因此，NIR-II成像临床转化的主要障碍是满足亮度和生物相容性要求的荧光团数量有限。花菁染料的发射光谱横跨整个NIR-I区域，发射尾部延伸到NIR-II窗口，因此，NIR-I探针可以被重新用于NIR-II生物成像，从而加速了这种成像方式向临床转化的过程。除了提供高对比度的**和血管成像，这些染料还表现出快速的肝胆清除。与无机纳米探针相比，减少了与生物相容性和安全性相关的问题。然而，由于循环时间短，这些染料为血管成像提供了不到2min的成像窗口。这些染料与蛋白质的生物结合可以延长循环时间，尽管这可能会因为猝灭效应而以亮度为代价。开发一种具有高QY和改善药代动力学特征的明亮的NIR-II荧光团仍然是一个挑战。

本研究调查了花菁染料与牛血清白蛋白(BSA)的组装是否会增加循环时间、量子产率、稳定性和成像对比度。通过实验和计算模拟，我们确定了一种自组装的IR-783@BSA，具有很高的稳定性和荧光强度，适合于高对比度成像。IR-783@BSA的循环时间延长，可在注射后3小时以超高对比度显示小于3μm宽的血管。IR-783与白蛋白之间的纳米分子结合亲和力促进了扭曲的分子内电荷转移(TICT)过程和NIR-II量子效率的提高。通过设计白蛋白和菁染料之间的超分子组装，该配合物可以保持扭曲的构象，从而能够提高TICT过程和循环时间。我们进一步证明，这种方法可以扩展到单克隆抗体(Erbitux)，以赋予分子靶向性。这项研究提供了一种简便的策略，通过用功能蛋白修饰菁染料来生产高性能的NIR-II荧光团，这在临床上显示出很高的潜力。

结果与讨论

通过超分子相互作用将菁染料与牛血清白蛋白组装在一起，以创建稳定的牛血清白蛋白包裹荧光团的复合物。首先评估了三种候选染料IR-783、IR-12N3和ICG (IR-12N3在BSA缓冲液中的相对QY是ICG的2.8倍)。我们研究了菁染料与BSA的相互作用，并测定了与解离常数Kd=1 nM的很强的结合亲和力。IR-783的相对近红外光谱QY与IR-12N3相近。在牛血清白蛋白存在的情况下，通过将每种染料加热到室温到90°C的温度来测试荧光团的温度依赖性。在60°C附近的温度下，荧光强度增加了大约6倍。由于菁染料的TICT，IR-783也显示出明亮的NIR-II尾部发射，启发我们优化所制备的复合物的NIR-II发射用于深度组织成像。我们使用四种合成策略制备复合物。第一个条件(C1)是将染料与牛血清白蛋白(BSA)自由混合，加热10 min形成复合物。第二种(C2)包括谷胱甘肽(GSH)和10分钟的加热，GSH促进二硫键的可逆断裂以捕获荧光团。第三组(C3)加入谷胱甘肽和戊二醛(GTD)，戊二醛是一种伯胺交联剂，加热10分钟。第四个(C4)指的是GTD和10分钟加热的组合。在优化荧光团与牛血清白蛋白(BSA)复合物的形成条件之前，我们利用FBS/PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲法建立了一个比值，通过监测荧光强度来测试该复合物的稳定性。所有被测荧光团在FBS中的荧光强度都高于在BSA中的荧光强度；因此，FBS/PBS中荧光团的荧光比最接近1表明与BSA笼的稳定性最高。我们测量了由上述四种方法(C1至C4)得到的三种荧光团@BSA配合物的荧光强度、大小和稳定性。IR-783@BSA复合物比IR-12N3@BSA和ICG@BSA复合物更稳定。此外，IR-783@BSA配合物在60°C加热后QY最高，荧光增强明显高于另外两个荧光团@BSA配合物。因此，我们选择IR-783@BSA进行进一步优化。优化程序包括优化染料和白蛋白的比例和浓度，混合后的预孵育时间，孵育后10分钟的加热温度(从室温到70°C)，以及优化稳定性和尺寸，以获得良好的荧光强度和体内药代动力学性能。我们首先优化了IR-783在自由混合(C1)和谷胱甘肽(C2)条件下的浓度依赖性，证实了BSA：IR-783的比例高达1：1，并具有优化的性质，如尺寸、荧光强度和络合物稳定性。反应体系的浓度控制在20 mg/mL以下，以避免聚集和过度交联。通过测量复合物在不同孵育时间点的稳定性和大小，将预孵育时间优化为24小时。为了进一步优化稳定性和发射亮度，在四种方法中的每一种都测试了三种不同比例的BSA：IR-783。我们观察到，当BSA：染料的比例为1：0.5和1：1时，复合物最稳定，而当比例为1：2时，复合物变得不稳定。在GSH(C2)和GSH+GTD(C3)条件下，复合物的平均粒径为~60 nm，而在自由混合(C1)和GTD(C4)条件下，复合物的平均粒径小于20 nm，表明GSH方法导致了分子间交联。透射电子显微镜、原子力显微镜和电泳分析也表明，与C1和C4相比，C2和C3产生了更大尺寸的复合物。从电泳分析中，我们观察到纳米复合物的单体、二聚体、三聚体和其他多聚体。因此，需要密度梯度离心法(DGU)纯化以将复合物从较小的物种中分离出来，以获得尺寸均匀的复合物。此外，10分钟的加热温度对于形成稳定的复合物也很重要，表明60℃和70℃满足了定制大复合物的需要，更高的温度可以产生更多的大纳米复合物。

图1。(A) 牛血清白蛋白包裹荧光团复合物形成示意图。(B) 用Kd值为1 nM的生物膜干涉法测定IR-783与白蛋白的动力学结合。(C) 预混牛血清白蛋白的染料加热10min后白度增强。(D) IR-783在牛血清白蛋白溶液中的吸收、近红外-I和近红外-II发射。(E) 60℃时，荧光团(IR-783、IR-12N3和ICG)与牛血清白蛋白(1：1比)的荧光增强。(F) IR-783@BSA复合物(C1~C4是在60°C后处理10min合成的)的电泳分析。(G) IR-783@BSA复合物的电泳凝胶分析。

本文通过对接建模研究IR-783和白蛋白之间的姿势和相互作用。IR-783的结合位点被鉴定为白蛋白的裂隙。虽然IR-783和ICG都被分配到相似的白蛋白结合位点，但ICG显示出更高的自组装倾向。自组装行为的偏离反映了染料分子自组装和染料与白蛋白相互作用这两个相互竞争的反应之间的不同趋势。我们去除了二硫键来模拟GSH处理后的部分变性白蛋白。通过平衡模拟得到了与IR-783进一步对接的最佳构象。产生的结合姿势在IR-783和白蛋白的Trp214之间显示出非常强的π-π堆积。色氨酸(Trp)是白蛋白中所有氨基酸残基中最大的结合系统。当共轭体系较大时，特别是当分子与附近的分子有π-π相互作用时，最高占据分子轨道-最低空分子轨道(HOMO-LUMO)间隙通常较小。它们面对的芳香环之间的距离被预测为3.761Å，这表明强电子耦合的距离非常短。IR-783和Trp214之间的强相互作用保持了IR-783的扭曲构象，使得TICT过程和NIR-II QY得以增强。增强的TICT过程进一步得到了在LC-BLYP*/6-31G(d)水平上的含时间密度泛函理论(TDDFT)计算的支持。图2F和图S5(G和H)中绘制了相应的静电势(ESP)表面的HOMO、LUMO和MAP图。对于NIR-I发射过程，计算的荧光波长为775 nm，与实验测量值800 nm一致。HOMO和LUMO均沿整个分子骨架分布，表明存在较强的π-π*局域激发发射。根据IR-783与白蛋白之间最佳结合姿势的对接建模，吲哚部分(二面角为90°)的旋转产生了一个不对称的π-共轭主链，导致电荷重新分布，进而诱导了TICT。计算的荧光波长增加到~1433 nm，这与我们研究中观察到的NIR-II发射相对应(从1000 nm增加到1500 nm)。由于IR-783和Trp214之间的距离很短(<4 Å)，我们将系统扩展到由IR-783和Trp214白蛋白组成的簇，使用相同的计算激发能的方法来理解IR-783@BSA情况下的高QY。计算结果表明，垂直激发包括从HOMO-1到LUMO的跃迁，其中HOMO-1几乎位于Trp214的吲哚环上，而LUMO位于IR-783相对于Trp214的近半侧。发射对应于从LUMO到HOMO的转变，在那里HOMO位于IR-783相对于Trp214的较远侧。在最终发射之前，将发生从HOMO(IR-783)到HOMO-1(Trp214)的电子跃迁。HOMO和HOMO-1中心之间的距离约为12 Å。由于QY与寿命成正比，与跃迁速率成反比，HOMO和HOMO-1之间的长距离解释了实验中IR-783@BSA的高QY。

图2。（A） IR -783@白蛋白复合物的对接建模。（B） IR-783和白蛋白之间的结合残基和活性口袋的细节。（C和D）IR-783和ICG的分子间堆叠。（E） IR-783和白蛋白与部分二硫键裂解的对接建模。（F） TICT诱导的IR-783的NIR-I和NIR-II状态转换的示意图。（G） LUMO（顶部），HOMO（中部）和HOMO-1（底部）是参与吸收（HOMO-1→LUMO）和发射（LUMO→HOMO）过程的三个主要分子轨道。（H） 吸收和发射形成三个步骤的循环。

我们使用优化的IR-783@BSA复合体进行了高对比度实时NIR-II血管成像。记录的小鼠后肢血管的NIR-II视频在1300纳米的亚NIR-II窗口上产生了超对比度血管成像。主成分分析(PCA)被应用于实时视频成像，以区分静脉和动脉血管，受益于最大SBR和灌注周期。在NIR-II动态成像中，在选定的5条血管上绘制感兴趣区(ROI)，时间为30min。在ROI的基础上，绘制的五个ROI的SBR值从1.3到7.6。我们进一步评估了IR-783@BSA复合物的高亮度提供发光二极管(LED)激发的NIR-II成像的能力。与785 nm激光激发成像相比，清晰的后肢成像记录在1300 nm以上，血管与肌肉信号比相等。与游离菁染料相比，延长IR-783@BSA复合物的设计提供了令人印象深刻的血管分辨率和更长的时间窗口。超亮IR-783@BSA复合体具有将NIR-II成像转化为临床应用的巨大潜力。

图3。(A) 记录的小鼠后肢血管在几个时间点的NIR-II视频。(B) 实时视频图像的PCA分析区分了静脉和动脉血管，以及小血管和背景。(C) 在(A)的NIR-II视频成像中对选定的五条血管的荧光强度剖面进行监测。(D) 在P.I.30min时血管与肌肉的信号比率。(E) IR-783@BSA复合体的高亮度可在较宽的NIR-II子窗口下提供低功率LED激发的后肢成像。(F) (E)中后肢的横截面强度剖面(虚线)。(H) LED激发NIR-II成像系统方案。(I) 与游离IR-783相比，IR-783@BSA复合体的血管循环时间延长。

在注射IR-783@BSA后，与来自NIR-I窗口的图像相比，在NIR-II窗口中对小鼠大脑的NIR-II显微成像提供了更清晰的血管轮廓，SBR大约增强了一倍。与活体NIR-II全身(2.5×)图像相比，剃光头的小鼠头部在P.I.<30min时的NIR-II全身图像。在IR-783@BSA复合物中，NIR-II显微镜图像具有更好的分辨率，照亮了小至3μm的血管。IR-783@BSA复合物和游离IR-783图像的血管与正常组织比率统计表明，IR-783@BSA复合物在NIR-II显微镜方法中显示出优越的血管成像能力。IR-783@BSA复合物的宽发射还潜在地实现了在NIR-I窗口具有峰值发射的双光子成像。

图4。(A) 小鼠脑的离体NIR-II显微镜成像。(B) 同一位置的NIR-I和NIR-II图像的横截面强度分布。(C) IR-783@BSA复合物作用于1300 nm和1200 nm长通滤光片后，分别进行了活体NIR-II全身(2.5×)、血管构型和离体显微镜成像。(D) IR-783@BSA复合体和自由IR-783图像的横截面强度分布。(E) IR-783@BS复合体和游离IR-783图像的血管与正常组织比率。

NIR-II窗口的分子成像具有显著的SBR比率和深层组织穿透性，可以提供癌症标记物表达的更全面的视图，以指导治疗。在IR-783@BSA复合物研究成果的推动下，我们开发了一种IR-783@Erbitux复合物，用于近红外II分子靶向成像。抗体和染料的复合物可以在NIR-II窗口中提供靶向成像。我们测试了IR-783@Erbitux复合物与阳性鳞状细胞癌细胞(SCC)和阴性U87细胞裂解物的靶向能力，表明在60°C的筛选反应条件下，表现出高荧光亮度，而不损失Erbitux对其受体的高靶向亲和力。IR-783@Erbitux复合物与先前IR-FGP@Erbitux共轭物的比较表明，IR-783@Erbitux复合物与IR-FGP@Erbitux共轭物相比具有更好的SBR，主要是因为IR-783的亮度增加。用IR-783@Erbitux染色的SCC细胞描述了基于抗体的复合物的持续靶向能力。尾静脉注射IR-783@Erbitux复合物和游离IR-783后，SCC荷瘤小鼠的体内NIR-II成像显示了开发的IR-783@Erbitux具有强大的靶向能力。24小时后，IR-783@Erbitux的NIR-II**信号比游离IR-783高2~3倍。尽管肝脏摄取率高于基于白蛋白的复合物，成像质量还不够高，IR-783@Erbitux仍有望实现简便的分子成像平台。这种络合有可能扩展到嵌入荧光团的功能性生物超分子，使其具有优异的成像能力的多功能。

图5。(A) IR-783@Erbitux复合物在阳性SCC细胞和阴性U87细胞上的细胞分析(裂解物)试验。(B) IR-783@Erbitux的鳞状细胞染色描述了基于抗体的复合物的保留靶向能力。(C) 尾静脉注射IR-783@Erbitux复合物，对荷鳞状细胞癌小鼠进行体内NIR-II成像。(D) 在与IR-783@Erbitux病例相同的成像条件下，尾静脉注射游离IR-783对一只SCC荷瘤小鼠进行体内NIR-II成像。(E) IR-783@Erbitux和游离IR-783在增加时间点P.I.的NIR-II**信号。(F) IR-783@Erbitux复合物在168小时时间点P.I.的体外生物分布。

结论

本文通过系统地剪裁花菁染料与血清白蛋白的超分子组装，确定了一种性能优越的复合物，具有更长的循环时间和优异的相对QY，揭示了牛血清白蛋白衍生的络合物与菁染料结合的机理，为改善菁染料的药代动力学提供了支持。通过应用GSH、GTD和热的组合获得了尺寸小于100 nm的自组装IR-783@BSA复合物，具有高稳定性和高荧光强度，使高对比度血管成像能够在~3小时的成像窗口内进行，并应用于抗体系统，通过IR-783@Erbitux复合物促进表皮生长因子受体靶向成像，从而实现了体外显微镜下的血管成像，以及体内全身成像，照亮了小至3μm的血管。该平台有可能扩展到其他分子靶点进行个性化治疗。

参考文献

Albumin-Chaperoned Cyanine Dye Yields Superbright NIR-II Fluorophore with Enhanced Pharmacokinetics, Rui Tian*, Qiao Zeng*, Shoujun Zhu, Joseph Lau, Swati Chandra, Robert Ertsey, Kenneth S. Hettie, Tarn Teraphongphom, Zhubin Hu, Gang Niu, Dale O. Kiesewetter, 

Haitao Sun, Xiaodong Zhang, Alexander L. Antaris, Bernard R. Brooks, Xiaoyuan Chen, Sci. Adv. 2019; 5: eaaw0672. DOI: 10.1126/sciadv.aaw0672. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aaw0672

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