大多数光动力疗法(PDT)都是通过高度依赖于O2的II型光反应生成单线态氧(1O2)。实体**缺氧微环境严重影响治疗效果，本文提出了一种新的设计，将传统的酞菁基光敏剂的光物理和光化学性质从II型光反应转移到高效的I型光反应和振动松弛诱导光热转换，在常氧和低氧条件下都能显示良好的光疗效果。此外，NanoPcAF在静脉注射后在**组织中有高水平的积累，在临床前模型中，0.8 nmol.g−1 NanoPcAF和300 J.cm−2光剂量时，94%的**生长被抑制。

光动力疗法(PDT)由于其低全身毒性和最小的侵袭性，已成为一种有前景的癌症治疗方式。大多数现有的PDT过程是基于II型光反应，这高度依赖于O2水平，涉及大量消耗O2。在实体**的不利微环境中，普遍的特征是严重的O2短缺。PDT介导的O2消耗和微血管破坏进一步加剧**缺氧，最终导致不满意的治疗结果。目前大多数PDT药物对**细胞和组织的靶向选择性较低，这些缺点也导致PDT尚未达到理想的效果。为了解决这个问题，文献采用纳米系统提供PDT试剂、O2或者催化剂，可以催化H2O2在原位生成O2 ，这些纳米体系通过增强EPR效应一定程度上提高PDT试剂的**选择性。然而，O2载体较差的载氧能力和**组织中较低的H2O2水平只能暂时和有限的缺氧缓解。此外，这些纳米系统通常需要复杂的构建模块和多步骤制备，从而阻碍其临床转化。因此，开发单组分而且不具有不依赖于O2的光治疗效果的纳米结构光敏剂。
本文设计并合成了多功能硅(IV)酞菁衍生物PcAF，PcAF在水溶液中通过自发组装形成均匀稳定的纳米球(NanoPcAF)。与传统酞菁高度依赖于O2的II型光反应不同，NanoPcAF表现出高效的I型光反应，产生丰富的超氧自由基(O2•−)和显著的振动松弛，从而诱导相对较高的光热转换效率。在低氧条件下，NanoPcAF产生的O2•−是亚甲基蓝(MB)的3.4倍。NanoPcAF的光热转换效率比吲哚菁绿(ICG)高2.4倍。系统给药后，NanoPcAF显示了极好的**聚集，**/肝脏比率高达5。在临床前模型中，光治疗过程中和之后没有观察到明显的毒性。

图1。 (a) PcAF的化学结构及其自组装形成NanoPcAF。(b) NanoPcAF的特性包括(I) I型PDT抗缺氧; (II)光热平均效能; (III)多通道成像; (IV)**聚集增强。

硅(IV)酞菁由于其在光治疗窗口(650 ~ 850 nm)的强吸收、高活性氧(ROS)量子产率以及通过轴向化学修饰可调谐的光化学性质等优点，已被广泛探索作为PDT的第二代PSs。到目前为止，两种硅(IV)酞菁(Pc4和RM-1929)目前正在临床试验中。然而，大多数现有的硅(IV)酞菁主要通过II型机制产生单重态氧(1O2)，高度依赖于O2水平，导致这种PDT对缺氧**的治疗效果有限。最近，Peng的团队报道了尼罗蓝衍生物在光照射下通过I型机制产生O2•−。受Peng工作的启发，我们引入与尼罗蓝结构类似的吩噻嗪结构(图2a)，以调节硅(IV)酞菁的光物理和光化学性质。该结构具有良好的生物相容性，带羟基的侧链有助于共价偶联。因此，我们设计两种具有一个或两个吩噻嗪的多功能硅(IV)酞菁衍生物。PcAF可以在水溶液中自组装形成均匀的纳米颗粒分布(NanoPcAF)， NanoPcAF的平均尺寸约为150 nm。透射电镜(TEM)结果显示NanoPcAF呈规则的球形，直径约为130 nm (图2c)。NanoPcAF在纯水和含10%胎牛血清(FBS)的水中放置1周以上，其平均尺寸、电子吸收光谱和荧光发射光谱均无明显差异。这些结果表明NanoPcAF具有良好的分散稳定性，这将有利于其在生物医学领域的应用。

为了更好地理解PcAF的自组装行为和组装机理，我们采用不含吩噻嗪的硅(IV)酞菁衍生物(PcA)和含两个吩噻嗪的硅(IV)酞菁(PcBF)研究它们的聚集现象。PcA在水溶液中自组装形成100 nm均匀的纳米颗粒分布(NanoPcA)。相对于NanoPcA的良好稳定性，PcA在时效超过1 h后出现了严重的聚集现象，尺寸约为1200 nm。1 d后PcA形成了团聚和沉淀。吩噻嗪基团在硅(IV)酞菁的自组装形成均匀稳定的纳米粒子中起着关键作用。PcBF在水溶液中自组装形成均匀的纳米颗粒分布(NanoPcBF)。此外，NanoPcBF在水中和含10%胎牛血清的水中表现出较好的稳定性。与NanoPcAF相比，NanoPcBF在水中表现出类似的吸收，但更强的荧光强度。这些结果再次表明，吩噻嗪基团的引入有利于硅(IV)酞菁的自组装，形成稳定的纳米颗粒。在酞菁硅(IV)上引入两个吩噻嗪基团可能使NanoPcBF的内部分子排列不够紧密，因为PcBF的自组装行为可能只是由于疏水性和π−π堆积。然而，除了PcAF分子之间的疏水相互作用和π−π堆积外，PcAF酚羟基之间的氢键相互作用也可能促进PcAF的自组装行为。因此，NanoPcBF比NanoPcAF具有更强的荧光发射，不利于光动力和光热效应的改善。

图2。(a) PcAF的合成路线及其自组装形成NanoPcAF的示意图。(b) DLS检测NanoPcAF在水中的粒径分布。(c) NanoPcAF的形貌。(d) NanoPcAF在水中时效不同时间后的平均粒径。(e) NanoPcAF和NanoPcBF (均为5 μM)在水中的吸收和荧光光谱(f)。
一般情况下，PS吸收的光子可以通过三种不同的方式释放，包括荧光、振动弛豫产生热量和进行系统间交叉(ISC)，生成有利于ROS生成的三重态。NanoPcAF在水中的荧光较弱，表明NanoPcAF在光热治疗(PTT)和光动力治疗(PDT)中具有巨大的潜力。为了确认NanoPcAF的光动力学特性，在后续实验中测量了NanoPcAF的O2•−和1O2生成效率。二氢乙啶(DHE)作为荧光探针检测O2•−。NanoPcAF在光照射下生成O2•−的能力是NanoPcA的3.2倍。与MB相比，NanoPcAF也表现出更好的生成O2•−的能力。在低氧条件下，测量了NanoPcAF生成O2•−的能力。在NanoPcAF组中，DHE探针在缺氧条件下的荧光强度与正常条件下相比没有显著降低。这说明纳米NanoPcAF在光照射下生成O2•−与O2水平无关。在缺氧条件下，NanoPcAF产生的O2•−比MB多3.4倍。我们还探索了NanoPcBF生成O2•−的能力。与NanoPcAF相比，NanoPcBF表现出较弱的O2•−生成，这可能是因为NanoPcBF吸收的光能以荧光的形式释放更多。与NanoPcBF相比，NanoPcAF具有更高的低氧**PDT潜力。随后，采用单氧传感器绿色(SOSG)作为荧光探针检测1O2。MB在光照射下产生了显著的1O2。而NanoPcAF组中SOSG的荧光强度在光照射后几乎没有增加，说明NanoPcAF产生1O2的能力可以忽略不计。这些结果表明NanoPcAF具有良好的I型光反应，吩噻嗪基团在其中起着关键作用。
图3。(a)NanoPcAF产生O2•−和热的可能机理示意图。(b)以DHE为荧光探针，在光照射下在水中O2•−生成NanoPcA、NanoPcAF和MB。用水作为对照。(c)在正常和缺氧条件下，光照射在水中生成NanoPcA、NanoPcAF和MB。(d) NanoPcAF和(e) NanoPcBF在光辐照水中的O2•−生成。(f)以SOSG为荧光探针，在光照射下水中NanoPcA、NanoPcAF和MB的1O2生成。

以水和ICG作为对照，研究了NanoPcAF的光热性能。NanoPcAF在水中的温度迅速升高，在光照射10 min后升高约30℃，而对照组的温度变化不明显。通过改变NanoPcAF的浓度和685 nm激光的能量密度来测量其在水中的光热效应。功率密度越大，温度升高越高。当激光功率密度保持在0.5 W cm−2时，还观察到显著的浓度依赖性温度升高。当NanoPcAF浓度为10 μM时，NanoPcAF在水中的温度达到57℃。NanoPcAF的光热转换效率达到18.3%，。此外，经过4次加热/冷却循环后，NanoPcAF没有观察到明显的光漂白。NanoPcAF的紫外-可见光谱在辐照10min后没有明显下降，而ICG在相同辐照时间内明显下降。这些结果表明NanoPcAF在PTT过程中保持了良好的光稳定性。NanoPcAF可以将传统硅(IV)酞菁的光物理和光化学性质从II型光反应转移到高效的I型光反应和振动松弛诱导光热转换。
图4。 (a)NanoPcAF和ICG(均为10 μM)在685和808 nm激光照射10 min下的随时间变化的温度。(b)不同功率密度(0,0.5，和1.0 W/cm2)的685 nm激光辐照NanoPcAF溶液10 min的温度升高。(d)NanoPcAF (10 μM)水悬浮液在激光多次曝光下的光稳定性测试。(e)NanoPcAF在685 nm激光照射10 min前后的吸收光谱;插图显示了NanoPcAF水悬浮液在光照前(左)和光照后(右)的照片。(f) 808 nm激光(0.5 W/cm2)照射10 min前后ICG的吸收光谱;插图显示ICG溶液在光照射前(左)和照射后(右)的照片。

首先评估了在常氧和缺氧条件下，NanoPcAF在人肝癌(HepG2)细胞内生成O2•−的能力。缺氧条件下厌氧指示器(ROS-ID)的荧光强度比正常条件下高6.9倍，说明后续体外实验成功构建了缺氧条件。随后，用DHE作为O2•−荧光指示剂检测NanoPcAF细胞内O2•−生成能力。在没有光照的情况下，NanoPcAF不能在细胞中产生O2•−。在685 nm光照射下，无论在常氧或低氧条件下，细胞都能观察到明显的DHE荧光。与常氧条件下相比，低氧条件下DHE荧光强度没有显示任何降低，表明NanoPcAF在常氧和低氧环境下均能诱导体外O2•−效率。此外，添加自由基清除剂维生素C (VC)后，细胞内O2•−降低了4.0倍，证实了NanoPcAF具有较强的生成O2•−的能力。我们还使用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为探针，检测HepG2细胞中NanoPcAF细胞内ROS的生成。当细胞与NanoPcAF孵育而没有光照射时，不产生ROS。然而，在685 nm激光照射后，DCFHDA在常氧和缺氧条件下都显示出明亮的绿色荧光，说明无论在常氧或缺氧条件下，NanoPcAF都能有效地产生ROS。与常氧状态相比，低氧状态下细胞内ROS并没有降低，这与O2•−检测结果一致。采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5 -二苯基- 2h -四唑溴化铵(MTT)比色法评价NanoPcAF的体外光治疗效果。NanoPcAF在黑暗环境下未观察到明显的毒性。而在685 nm光照，NanoPcAF在常氧和低氧条件下均表现出显著的浓度依赖性细胞毒性，90%的抑制浓度(IC90)分别为0.45±0.08 μM和0.42±0.10 μM。这些结果表明，O2浓度对NanoPcAF的细胞毒性没有影响。为了进一步证实NanoPcAF的体外光疗机制，一方面用VC处理细胞清除自由基。与NanoPcAF +光组相比，NanoPcAF + VC +光组的治疗效果明显下降，这应该是PDT受到抑制的结果。另一方面，冰袋被用来控制细胞的温度。与NanoPcAF +光组相比，NanoPcAF +冰+光组的细胞抑制作用也降低。NanoPcAF +冰+光组的IC50达到3.69±0.12 μM，是NanoPcAF +光组的8.2倍。这些结果表明PTT在光细胞毒性中也起重要作用。活/死细胞染色实验结果也表明PTT和PDT在NanoPcAF诱导细胞死亡的光细胞毒性中发挥了重要作用。NanoPcAF由于其优越的I型PDT和PTT能力，在常氧和缺氧条件下均具有较高的体外光治疗效果。这些结果进一步表明，NanoPcAF在光动力治疗中表现出高的I型光反应和光热作用协同效率来克服缺氧条件。
图5。 (a)使用ROS-ID作为厌氧指标进行细胞内缺氧成像，并量化相应的细胞内平均荧光强度。(b)共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像(i)控制(无光)，(ii)常氧，(iii)缺氧，(iv)维生素C (VC)条件下常氧，在685 nm光下，使用DHE作为荧光探针10分钟，检测HepG2细胞中的NanoPcAF。(c)在(i)对照(无光)、(ii)常氧、(iii)低氧、(iv) VC存在下，以DHE作为荧光探针，在685 nm光照射10分钟下，定量HepG2细胞中相应的胞内O2•−生成NanoPcAF。(d)以DCFH-DA作为荧光探针，在685 nm光照射下，(i)对照(无光)、(ii)常氧、(iii)缺氧条件下，细胞内ROS生成的CLSM图像和相应的细胞内ROS生成的定量。(e)在常氧或缺氧条件下，NanoPcAF对HepG2细胞的细胞毒性作用。(f)NanoPcAF对HepG2细胞的PDT(冰+光)和PTT (VC +光)效应。(g)荧光显微镜检测Calcein-AM/PI共染(标尺= 250 μm)。将细胞分为4组(i)对照(无光)、(ii) NanoPcAF + VC + 685 nm光、(iii) NanoPcAF +冰+ 685 nm光、(iv) NanoPcAF + 685 nm光。绿色通道为Calcein-AM染色，红色通道为PI染色。

以肝癌(H22)小鼠为实验对象，静脉注射NanoPcAF，观察NanoPcAF的生物分布。选择H22是因为它相对容易建立**模型。利用荧光成像技术评价NanoPcAF在体内的生物分布。荧光图像连续监测至24 h，发现**部位的荧光信号逐渐增加，在10 h时达到最大值。虽然NanoPcAF在水中的荧光非常弱，荧光成像结果显示，注射NanoPcAF 10 h后，荧光信号清晰，且几乎只出现在**部位，这可能是由于NanoPcAF具有显著的**聚集能力，并在**部位恢复了荧光生成。老鼠牺牲24小时接受和**的荧光强度和其它主要器官包括皮肤、心、肝、脾、肺、肾进行评估。**部位的荧光信号远高于其他器官。**的荧光强度是肝脏的5.1倍。这个**/肝脏的比值比大多数报道的PSs要高得多，表明NanoPcAF具有出色的**靶向能力。为了研究NanoPcAF在体内的稳定性，还利用体内荧光成像技术评价了NanoPcAF在含10%胎牛血清的水中的生物分布。如图6a所示，荧光成像结果与在纯水中注射NanoPcAF的小鼠相似。此外，由于CEL是一种常见的表面活性剂，可以破坏PSs的自组装，因此在注射小鼠之前，我们使用cremoophor EL (CEL)破坏NanoPcAF的结构。在含1% CEL (v/v)的水中，PcAF在吸收光谱中呈现强烈吸收，在610 nm激发下发出强烈的荧光，说明NanoPcAF的纳米结构被CEL破坏。将含1% CEL的NanoPcAF注入荷瘤小鼠体内，荧光信号迅速扩散至全身，然后逐渐减弱，无明显**积聚。体外荧光分布也显示，荧光信号主要存在于肝脏。这些结果表明，NanoPcAF在生理环境中具有良好的稳定性，而未断裂的纳米结构在**选择性中发挥着关键作用。其次，利用光热成像监测NanoPcAF在体内的**积累。H22**小鼠静脉注射NanoPcAF。使用685 nm激光(0.5 W cm−2)每隔一小时照射**部位3分钟。在照射过程中，通过红外热像仪持续评估**部位的温度。热成像持续监测至24小时。注射NanoPcAF 10小时后，**部位温度明显升高，约升高28°C。光热成像观察到的**富集时间与上述荧光成像结果一致。
图6。(a)体内和(b) H22荷瘤小鼠静脉注射NanoPcAF前后的体内和体外荧光图像。(c)在200 μM的不同溶液(纯净水、含10%胎牛血清的水或含1% CEL的水)中静脉注射NanoPcAF后，对H22荷瘤小鼠不同器官和**组织的荧光强度进行定量分析。(d)在685 nm光照下静脉注射NanoPcAF后H22荷瘤小鼠的体内实时光热成像和(e)温度变化。

由于NanoPcAF具有良好的**聚集能力，我们进一步对H22荷瘤小鼠进行了体内光治疗。小鼠分为6组：(1)对待PBS(控制),(2)关照1(激光波长685 nm),(3)光照2(激光波长685 nm),(4) NanoPcAF,(5) NanoPcAF + light 1, 和(6) NanoPcAF + light 2，NanoPcAF联合光2照射小鼠后，温度升高约30°C。仅用光2处理的小鼠和先用NanoPcAF再用光1处理的小鼠的温度都有轻微变化。然后，每隔一天对各组小鼠的体重和**体积进行评估。各组小鼠体重无明显差异，并在治疗过程中保持稳定增长。小鼠**体积在不同组之间显示出显著的变化。所有对照组(包括PBS、light 1、light 2和NanoPcAF单独)均显示出显著水平的**生长，而NanoPcAF + light 1组和NanoPcAF + light 2组的**生长均受到明显抑制。14天之后,**治疗的老鼠1 NanoPcAF其次是光辐照表现出抑制增长64%,这应该来自PDT的影响是引起**部位的温度显示一个微不足道的增加后,老鼠接受NanoPcAF光1紧随其后。与NanoPcAF + light 1组相比，NanoPcAF + light 2组的**抑制效果显著提高(94%)，这应该得益于PDT和PTT的联合作用。因此，这些结果表明，NanoPcAF通过PTT与I型PDT联合具有高效的抗**能力。代表性图像和**平均重量进一步证实了NanoPcAF在光照射下具有显著的抗**效果。
图7。 (a)含H22**小鼠的红外热成像。(b)治疗后小鼠H22**温度变化曲线。光:685 nm激光。(c)小鼠在相应处理下的平均体重变化。(d) H22荷瘤小鼠经各种治疗后的**生长曲线。(e)具有代表性的**图像和(f)适应症治疗14天后的平均**重量。

本文开发了一种新型的纳米结构NanoPcAF，基于硅(IV)酞菁与奋宁轴向单取代的自组装。NanoPcAF与传统PSs不同，后者通过II型机制作为PDT生成1O2。NanoPcAF通过I型机制产生了丰富的O2•−，并具有良好的光热性能，使其能够克服PDT中的**缺氧。荧光成像和光热成像结果表明NanoPcAF在静脉注射后有明显的**聚集。因此，NanoPcAF具有很好的I型光反应和光热作用协同抑制**生长的作用。结果表明，NanoPcAF在临床上是一种很有前景的低氧**治疗光敏剂。

Nanostructured Phthalocyanine Assemblies with Efficient Synergistic Effect of Type I Photoreaction and Photothermal Action to Overcome Tumor Hypoxia in Photodynamic Therapy. Yuan-Yuan Zhao, Ling Zhang, Zixuan Chen, Bi-Yuan Zheng, Meirong Ke, Xingshu Li,* Jian-Dong Huang*. : J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 13980−13989 .DOI: 10.1021/jacs.1c07479
https://doi.org/10.1021/jacs.1c07479