NH2-PEG-NH2双氨基聚乙二醇的制备具体步骤和表征

　聚乙二醇[po ly(ethylene glyco l) , PEG ]具有良好的生物、血液相容性[ 1, 2 ]和亲水性, 无免疫原性, 常用来修饰蛋白质、多肽、酶等生化药物[ 3～ 5 ]和生物医用材料[ 6 ]。由于通过环氧乙烷或乙二醇聚合得到的PEG 端基是反应活性较低的羟基, 只能在较激烈的条件下与其它基团发生反应, 易破坏被修饰物, 实际应用时常需先进行活化。PEG 传统活化方法有酯化法[ 7 ]、氰脲酰氯法[ 8 ]等。本文采用对甲苯磺酸酯法进行活化, 制得分子量为4000 和10000 的双端氨基聚乙二醇(A T 2PEG, 1) , 产率和转化率高, 除端基发生改变外, 不会在PEG 分子链上引入其它基团, 避免影响被修饰物的活性。

NH2-PEG-OH

NH2-PEG-Hydrazide

NH2-PEG-Silane

NH2-peg-Acrylates

NH2-peg-Lipoic acid

NH2-peg-Acetylthio

NH2-PEG-Nitrophenyl Carbonates (NPC)

NH2-PEG-ValericAcids

NH2-PEG-Acrylamide

NH2-PEG-Bromide(Br)

NH2-PEG-Vinylsulfone(VS)

NH2-PEG-Methacrylate(MA)

NH2-PEG-Iodoacetate(IA)

NH2-PEG-Chloride

DBCO-PEG-NH2

TCO-PEG-NH2

Tetrazine-PEG-NH2

NH2-PEG-Folate

NH2-PEG-CHEMS

1　材料和方法

1. 1　仪器与材料

V arian INOVA 500 型核磁共振仪, 溶剂CDCl3, 内标TM S, 测试温度26. 0℃; V ario EL 型元素分析仪( 德国Elementar公司)。对甲苯磺酰氯[T sCl, 广州化学试剂厂, 化学纯, 用苯2石油 (60～ 90℃) (1∶20, vöv ) 重结晶1 次, 真空40℃烘干1 d ]; PEG (广州化学玻璃试剂公司, 数均分子量分别为4000和10000, 于120℃减压搅拌4 h)。

1. 2　合成方法

PEG 的转氨反应见图1。取PEG 4 K (20g,5 mmo l) 溶于CH2Cl2 (100m l) , 加入T sCl (3. 81g,20 mmo l) 的吡啶(76 m l) 溶液, 充分混合, 室温反应24 h, 用3 mo löL HCl (470 m l) 萃取, 有机层加入碳酸氢钠(5 g) 剧烈搅拌, 过滤, 滤液蒸干得白色粉末状PEG2对甲苯磺酸酯(2) 粗品(17. 42 g, 87% )。

40℃搅拌下将2 粗品溶于THF (8. 7m l) , 将其逐滴滴至剧烈搅拌的乙醚(435m l) 中, 析出沉淀后过滤,真空干燥得2 纯品(16. 01 g) , 连同25%～ 28% 氨水(160 m l) 置250 m l 耐压容器中, 于140℃密闭反应6 h 后冷至室温, 用CH2Cl2 (160 m l) 萃取, 向有机层[ 约140 m l, 含PEG2对甲苯磺酸铵盐(3) ] 中加入1 mo löLNaOH 水溶液(140 m l) ,搅拌2 h 后静置,

分出有机层, 水洗至中性, 蒸干后即得A T 2PEG4K12. 25 g。同法进行PEG 10 K 的转氨反应。采用酸碱滴定法测定PEG 的端羟基浓度和1的端氨基浓度[ 8 ]。分别取PEG、2、3 及1, 用适量THF 溶解, 加入乙醚后析出沉淀, 过滤后于30℃真空干燥。如此重复3 次, 得到的样品进行1HNMR 检测和元素分析, 计算氨基的摩尔数及羟基转为氨基的反应转化率。

Boc-NH-PEG-NH2

Boc-NH-PEG-COOH

Boc-NH-PEG-MAL

Boc-NH-PEG-NHS

Boc-NH-PEG-N3

Boc-NH-PEG-Alkyne

Boc-NH-PEG-SH

Boc-NH-PEG-Biotin

Boc-NH-PEG-CHO

Boc-NH-PEG-OPSS

Boc-NH-PEG-Hydrazide

Boc-NH-peg-silane

Boc-NH-peg-Acrylates

Boc-NH-peg-Lipoicacid

Boc-NH-peg-Tosylate

Boc-NH-peg-Acetylthio

Boc-NH-PEG-Aminooxy

Boc-NH-PEG-NitrophenylCarbonates (NPC)

Boc-NH-PEG-SAS

Boc-NH-PEG-SC

Boc-NH-PEG-SCM

Boc-NH-PEG-SG

Boc-NHPEG-SS

Boc-NH-PEG-SVA

Boc-NH-PEG-Epoxides

Boc-NH-PEG-ValericAcids

Boc-NH-PEG-Acrylamide

Boc-NH-PEG-Bromide(Br)

Boc-NH-PEG-Vinylsulfone(VS)

Boc-NH-PEG-Methacrylate(MA)

2　结果与讨论

2. 1PEG 酯化反应

2 的1HNMR 谱(图2) 中出现了苯环的芳香质子(D7. 15, d, 甲基邻位的芳香质子; D 7. 34, d, 甲基间位的芳香质子) ; D 7. 80, d, 可能是杂质锋; D2. 45 为甲基单峰; 重复单元- CH2 -CH2 - O - 的亚甲基质子(D 3.65,m ) ; 生成的新键(- CH2-CH2 - O TS) 中与硫酸酯基相连的亚甲基质子(D4.15, t) 等特征吸收峰, 说明PEG 的端羟基确实发生了对甲苯磺酸酯化反应。

2. 23 的生成

2 与氨水反应不同时间后所得产物的元素分析结果见图3。由图3 可见, 6 h 后氨基转化率基本不变。高温高压下, 2 极易和氨水反应生成3, 随着温度上升, 反应速率增加, 但对耐压容器的要求也提高。为得到较高的反应速率和转化率又不致使成本过高,本实验选择反应温度为140℃, 反应时间为6 h。

2. 31 的合成

3 经N aOH 碱洗生成氨基游离的1。反应液用大量水洗至中性。A T 2PEG4K 的1HNMR 谱见图4。

图4AT-PEG4K 的1HNMR 图谱

除D 3. 65 处仍保留- CH2 - CH2 - O - 中的亚甲基质子峰外, 在D 3. 17 和D 3. 48 处分别出现了生成的新键(NH2- CH2 - CH2 - O - ) 中与端氨基相连的亚甲基质子峰及与氧相连的亚甲基质子峰。酸碱滴定及元素分析法测得不同分子量PEG的端羟基浓度、活化后端氨基浓度及转化率见表1。对甲苯磺酸酯法活化PEG 后, 端氨基的转化率均较高, 当PEG 的分子量为4000 时, 甚至可达92. 8%(元素分析法)。PEG4K 比PEG10K 的端羟基转化率高, 可能的原因是: 分子量小的聚合物更易溶解,

Fmoc-NH-PEG-COOH

Fmoc-NH-PEG-MAL

Fmoc-NH-PEG-NHS

Fmoc-NH-PEG-N3

Fmoc-NH-PEG-Alkyne

Fmoc-NH-PEG-SH

Fmoc-NH-PEG-Biotin

Fmoc-NH-PEG-CHO

Fmoc-NH-PEG-OPSS

Fmoc-NH-PEG-Hydrazide

Fmoc-NH-peg-silane

Fmoc-NH-peg-Acrylates

Fmoc-NH-peg-Lipoicacid

Fmoc-NH-peg-Tosylate

Fmoc-NH-peg-Acetylthio

Fmoc-NH-PEG-Aminooxy

Fmoc-NH-PEG-NitrophenylCarbonates (NPC)

Fmoc-NH-PEG-SAS

Fmoc-NH-PEG-SC

Fmoc-NH-PEG-SCM

Fmoc-NH-PEG-SG

Fmoc-NHPEG-SS

Fmoc-NH-PEG-SVA

Fmoc-NH-PEG-Epoxides

Fmoc-NH-PEG-ValericAcids

Fmoc-NH-PEG-Acrylamide

Fmoc-NH-PEG-Bromide(Br)

其分子链在溶剂中完全舒展开,端羟基都暴露在外;分子量大的PEG 则可能因为分子间的相互作用力太大而使链相互缠绕成线团状, 端羟基有可能被包埋起来, 减少了参与反应的几率; 另外, 分子量越大,空间位阻越大, T sCl 越难接近分子链上的端羟基,即分子量增加后, 官能团之间的碰撞反应几率降低,因此反应转化率降低。另外从表中还可以看出, 元素分析法得到的反应转化率比酸碱滴定法得到的大得多。导致差异的可能原因是:① 酸碱滴定测大分子物质端氨基时,目测终点判断较困难, 导致测得的端氨基浓度偏低;② 酸碱法测得的端羟基浓度偏高; ③ 计算转化率时, 元素分析以[ - OH ]理论值为基数, 酸碱滴定以[ - OH ]实测值为基数。